עיכוב חלבונים inducible והפיך דומיננטי שלילי (DN)

רוב הגישות מכוון ablations גנים וחלבונים להסתמך על תהליכים קבועים, אשר בדרך כלל להוביל חיסול מוחלט או חיתוך של ג’ין, רצפי RNA או החלבון עניין (פוי). המטרה הכוללת של שיטה זו הוא מהנדס חלבון רקומביננטי לבטל את הפונקציה של אנדוגני, פראי-סוג חלבון. יש וביקרה ואנו בנגיעות של אסטרטגיה אלטרנטיבית^1,2, מה שמאפשר עבור אבלציה זמני של נקודת משחק לחץ באמצעות עיכוב DN. שיטה זו פועלת multimeric וגם פפטידים monomeric אך היא המתאימה ביותר עבור חלבונים שפועלים בהרכבה multimeric.

השיטה מורכבת פיוזינג lysosomal פרוטאז CB יחידת משנה של multimeric פוי (CB פיוז’ן מורכבים). פיוז’ן CB תוצאות מורכבות יכול לקיים אינטראקציה עם proteolytically לעכל החלבון אנדוגני או להסיט את המתחם כולו CB-פוי ליזוזום להיות מפורק³. יתר על כן, שילוב של פיוז’ן CB מורכבים עם הטבע inducible של מערכת ההפעלה תעתיק שבשליטת טטרציקלין (TetO) מאפשר ביטוי inducible ומבוקר transgene ב אופנה הפיך². למרות שימושי בנסיבות רבות, מחיקה מלאה של גנים או חלבונים ויוו יכול לגרום קטלני^4,5,6. באופן דומה, מחיקה רקמות ספציפיות, מותנה של כמה גנים או חלבונים באמצעות מערכת Cre/סלומון לא יכול להיות ישירה, כמו, בסופו של דבר, תוביל לאובדן תמידי של אלמנטים קריטיים גנומית⁷. לפיכך, בהתאם ג’ין או פוי, וגם יהיה יעיל במתן מודל שימושי עבור מחקרים מאוחרים יותר, במיוחד של הגנים או של חלבונים פונקציונליים מחקרים בעכברים כמחנכת ומבוגרים מאוחר.

כדי לעקוף בעיות הקשורות גישות כאלה לספק הוכחה של עקרון על היעילות של השיטה המוצעת, בחרנו לבחון את השיטה המובאת כאן על ידי יצירת גירסה DN מותנה של החלבון 1 רטינובלסטומה (RB1). מספר אפשרויות להיות המוצע^8,9,10 לבטל את הפונקציה של אנדוגני RB1; עם זאת, כולן בפני חלק מהמגבלות באותו שנדונו לעיל: germline קבוע מחיקה של RB1 embryonically קטלני, והוא, בקנה אחד עם תפקידו משתיק קול הגידול, קבע RB1 מחיקה מותנה שמוביל מגוון רחב של גידולים¹¹. אף-על-פי גירסת DN RB1 לא נראה להתרחש באופן טבעי, חלופה טובה יותר האסטרטגיות הזמינות כעת צריך לאפשר איון חנותם מבוקרת של RB1 אנדוגני ולספק מנגנון חלופי לשחזור בסופו של דבר שלה פונקציה. בסיס כזה מבנה תוארה לפני למעלה משני עשורים¹. עם זאת, בשל מגבלות טכנולוגיות, זה חסרה מנגנון הבקרה transgene ההפעלה, התגובה של רקמות ירידה לפרטים. מחקר זה הוא הראשון כדי לשלב את האלגנטיות דוקסילין (Dox)-תלוי תעתיק המערכת עם הבונה מהונדס מהונדס של חלבונים CB, Rb1 פרוטאז lysosomal. המודל העכבר CBRb המתקבל מאפשר RB1 בתיווך Dox מוסדר באופן זמני תקנה². היתרון של שימוש כזה מבוסס פרוטאום בגישה ללמוד ג’ין פונקציה היא כי זה יכול להיות מאומץ עבור ג’ין בכל עניין, עם מידע מינימלי על פעילותה.

האסטרטגיה המוצעת DN transgene מציע יתרונות רבים על פני הגישות המסורתיות. ראשית, עיכוב חלבונים DN מוביל רק אבלציה חלקית בפעילות חלבון, וכך לשמר ביטוי אנדוגני שיורית. כזו כ”בלתי רצוי מאוד במצבים איפה חיסול מוחלט של פעילות החלבון מוביל lethality עובריים, במידה רבה להגביל חקירה כלשהי ללמוד ג’ין פונקציית עכבר חי. שנית, הנוכחות של מערכת TetO מאפשרת הפעלת transgene רק בנוכחות אנטיביוטיקה, מה שמאפשר עבור פקד יעיל של הפיכה של הפעילות transgene. לפיכך, על ידי חדל המינהל לאנטיביוטיקה, ניתן לבטל את הפעלתם את המערכת הטרנסגניים, ביטוי RB1 נורמלי הוא למקום. שלישית, יחודיות של הביטוי transgene יכול להשתנות בהתאם האמרגן של הבחירה. בעוד שבחרנו את המקדם רוזה-חטיבתי בכל מקום על הוכחה של עקרון, הצבת את transgene תחת מקדם רקמות ספציפיות סביר להגביל את הביטוי transgene לא רצויים וכדי להקל על מחקרים על היישום טיפולית של transgene הזה מתודולוגיה.