Inhibition de protéine inductible et réversible Dominant négatif (DN)

La plupart des approches visant à l’ablation des gènes et des protéines s’appuient sur des processus permanents, qui se traduisent généralement par l’élimination complète ou la troncation de la gène, de séquences d’ARN ou protéine d’intérêt (POI). L’objectif général de cette méthode est à l’ingénieur une protéine recombinante pour l’abolition de la fonction des protéines endogènes, sauvage. Nous avons revu et remanié une stratégie alternative^1,2, qui permet l’ablation temporaire d’un POI par inhibition de la DN. Cette méthode fonctionne pour les multimères et peptides monomères mais est plus adaptée pour les protéines qui fonctionnent dans une assemblée de multimères.

La méthode consiste à fusionner la protéase lysosomale CB à une sous-unité d’un multimériques POI (complexe de fusion de CB). La résultante complexe de fusion CB peut interagir avec et clivage protéolytique digérer la protéine endogène ou détourner l’ensemble CB-POI pour le lysosome être dégradées³. En outre, une combinaison de la fusion de CB complexe avec le caractère inductible du système contrôlé par tétracycline l’activation transcriptionnelle (Fifi) permet une expression inductible et contrôlée du transgène dans un mode réversible². Bien qu’utiles dans de nombreuses circonstances, la suppression complète des gènes ou des protéines in vivo peut entraîner la létalité^4,5,6. De même, tissu-spécifique, conditionnelle délétion de certains gènes ou les protéines utilisant le système Cre-Lox ne peut pas être simple, comme elle, en fin de compte, entraînera la perte permanente des éléments critiques de génomique⁷. Par conséquent, selon le gène ou POI, aucune de ces approches seront efficaces en fournissant un modèle utile pour des études ultérieures, en particulier des gènes ou des protéines des études fonctionnelles chez les souris adultes et postnatals fin.

Pour contourner les problèmes liés à ces approches et fournir preuve de principe sur l’efficacité de la méthode proposée, nous avons choisi de tester la méthode présentée ici en générant une version DN conditionnelle de la protéine du rétinoblastome 1 (RB1). Plusieurs options ont été proposées^8,9,10 à abolir la fonction de RB1 endogène ; Cependant, chacun d’eux fait face à certaines limitations mêmes discutées plus haut : suppression de cellules germinales permanente de RB1 est mortelle embryonnaire et, conforme à son rôle de suppresseur de tumeur, permanente RB1 suppression conditionnelle mène à une variété de tumeurs¹¹. Même si une version DN de RB1 ne semble pas se produire naturellement, une meilleure alternative pour les stratégies actuellement disponibles devrait permettre une inactivation temporellement contrôlée de la RB1 endogène et prévoient un autre mécanisme pour finalement restaurer sa fonction. La base d’une telle construction a été décrite il y a plus de vingt ans¹. Toutefois, en raison des limitations technologiques, il lui manquait un mécanisme d’activation de transgène de contrôle, d’intervention et spécificité tissulaire. Cette étude est le premier à combiner l’élégance de la doxycycline (Dox)-système transcriptionnelle dépendant par une ingénierie construction transgénique de protéines de CB et Rb1 protéases lysosomales. Le modèle de souris CBRb qui en résulte permet une RB1 temporairement réglementée de Dox-mediated règle². L’avantage d’utiliser une approche axée sur le protéome pour étudier la fonction du gène est qu’il peut être adopté pour n’importe quel gène d’intérêt, avec un minimum d’informations sur son activité.

La stratégie proposée du transgène DN offre de nombreux avantages par rapport aux approches traditionnelles. Tout d’abord, l’inhibition de protéine DN mène à seulement une ablation partielle en activité de la protéine, préservant ainsi une expression endogène résiduelle. Un tel résultat est hautement souhaitable dans des situations où une élimination complète de l’activité de la protéine entraîne une létalité embryonnaire, limitant grandement toute enquête pour étudier la fonction des gènes dans une souris vivante. En second lieu, la présence du système TetO permet l’activation du transgène qu’en présence d’un antibiotique, ce qui permet un contrôle efficace et réversible de l’activité du transgène. Ainsi, en cessant l’administration d’antibiotiques, le système transgénique peut être désactivé, et une expression normale de la RB1 est remis en place. En troisième lieu, la spécificité de l’expression de transgènes peut varier selon le promoteur de choix. Alors que nous avons choisi le promoteur omniprésent de ROSA-CAG pour preuve de principe, plaçant le transgène sous un promoteur spécifique aux tissus est susceptible de restreindre l’expression transgénique non désirées et de faciliter les études sur l’application thérapeutique de ce transgène méthodologie.