Inibizione della proteina viscoelastica e reversibile dominante-negativo (DN)

Maggior parte degli approcci puntando le ablazioni di gene e la proteina si basano su processi permanenti, che generalmente conducono alla completa eliminazione o troncamento del gene, sequenze di RNA o proteine di interesse (PDI). L’obiettivo generale di questo metodo è quello di progettare una proteina ricombinante per abolire la funzione della proteina endogena, selvaggio-tipo. Abbiamo rivisitato e rinnovato una strategia alternativa^1,2, che permette per l’ablazione temporanea di un PDI tramite inibizione di DN. Questo metodo funziona per multimerici e peptidi monomerici ma è più adatto per proteine che funzionano in un assembly multimerica.

Il metodo consiste di fondere la proteasi lisosomica CB per una subunità di un multimerico PDI (fusione di CB complessi). La risultante fusione CB complessa possa interagire con e proteoliticamente digerire la proteina endogena o deviare l’intero complesso di CB-POI per i lisosomi per essere degradati³. Inoltre, una combinazione di fusione CB complessa con la natura viscoelastica del sistema controllato tetraciclina attivazione trascrizionale (TetO) permette un’espressione inducibile e controllata del transgene in un modo reversibile². Anche se utile in molte circostanze, l’eliminazione completa dei geni o proteine in vivo può provocare mortalità^4,5,6. Allo stesso modo, tessuto-specifici, condizionale cancellazione di alcuni geni o proteine utilizzando il sistema Cre/Lox potrebbe non essere semplice, come, in definitiva, porterà alla perdita permanente di elementi critici genomico⁷. Pertanto, a seconda del gene o POI, nessuno di questi approcci sarà efficace nel fornire un utile modello per studi successivi, particolarmente dei geni o proteine studi funzionali in topi ritardo postnatali e adulti.

Per aggirare i problemi connessi con questo tipo di approccio e di fornire prova di principio sull’efficacia del metodo proposto, abbiamo scelto di testare il metodo presentato qui generando una versione di DN condizionale della proteina 1 di Retinoblastoma (RB1). Diverse opzioni sono state proposte^8,9,10 per abolire la funzione di RB1 endogeno; Tuttavia, tutti loro ha affrontato alcune delle stesse limitazioni discusse sopra: l’eliminazione permanente di germline di RB1 è embrionalmente letale, e coerente con il suo ruolo di soppressore del tumore, permanente eliminazione condizionale RB1 porta a una varietà di tumori¹¹. Anche se una versione di DN di RB1 non sembra verificarsi naturalmente, un’alternativa migliore alle strategie attualmente disponibili dovrebbe consentire un’inattivazione temporaneamente controllata di RB1 endogeno e fornire un meccanismo alternativo per ripristinare alla fine suo funzione. La base per tale costrutto è stato descritto più di due decenni fa¹. Tuttavia, a causa di limiti tecnologici, mancava un meccanismo di attivazione del controllo del transgene, risposta e specificità tissutale. Questo studio è il primo a combinare l’eleganza di doxiciclina (Dox)-sistema trascrizionale dipendente con un costrutto transgenico ingegnerizzato di proteine di proteasi lisosomica CB e Rb1 . Il modello di mouse CBRb risultante permette per un temporaneamente regolamentato RB1 Dox-mediata regola². Il vantaggio dell’utilizzo di tali un approccio basato sul proteoma per studiare la funzione del gene è che possa essere adottata per ogni gene di interesse, con informazioni minime sulla sua attività.

La strategia proposta del transgene DN offre molti vantaggi rispetto ai metodi tradizionali. In primo luogo, l’inibizione della proteina di DN conduce a solo un’ablazione parziale attività proteica, preservando in tal modo un’espressione endogena residua. Tale risultato è altamente desiderabile in situazioni dove un’eliminazione completa dell’attività della proteina conduce alla mortalità embrionale, limitando notevolmente qualsiasi indagine per studiare la funzione del gene in un mouse dal vivo. In secondo luogo, la presenza del sistema TetO consente l’attivazione di transgene solo in presenza di un antibiotico, che consente un controllo efficace e reversibile dell’attività del transgene. Così, cessando la somministrazione di antibiotici, il sistema transgenico può essere disattivato, e una normale espressione di RB1 è tornato a posto. In terzo luogo, la specificità dell’espressione del transgene può variare secondo il promotore della scelta. Mentre abbiamo scelto il promotore di ROSA-CAG onnipresente per prova-de-principio, ponendo il transgene sotto un promotore tessuto-specifico rischia di limitare l’espressione del transgene indesiderati e facilitare gli studi sull’applicazione terapeutica di questo transgene metodologia.