Induzierbaren und Reversible Dominant-Negative (DN) Protein Hemmung

Die meisten Ansätze mit dem Ziel der Gene und Proteine Ablationen setzen auf permanente Prozesse, die in der Regel zur vollständigen Beseitigung oder Kürzung des Gens, RNA-Sequenzen oder Protein von Interesse (POI) führen. Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist ein rekombinantes Protein zur Abschaffung der endogenen, Wildtyp Protein-Funktion zu konstruieren. Wir haben neu aufgelegt und überarbeitet eine alternative Strategie^1,2, die für die temporäre Ablation eines POI durch DN Hemmung ermöglicht. Diese Methode funktioniert für Multimeric und Monomeren Peptide aber eignet sich am besten für Proteine, die in einer Assembly Multimeric funktionieren.

Die Methode besteht darin, der Verschmelzung der lysosomalen Protease CB an eine Untereinheit von einem Multimeric POI (CB Fusion Komplex). Die resultierende komplexe CB-Fusion kann interagieren mit und proteolytisch das körpereigene Protein zu verdauen oder umleiten den Gesamtkomplex der CB-POI zu den Lysosomen abgebaut³sein. Darüber hinaus ermöglicht eine Kombination aus der komplexen CB-Fusion mit der induzierbaren Natur des Systems der Tetracyclin-gesteuerte transkriptionelle Aktivierung (TetO) einen induzierbaren und kontrollierte Expression des Transgens in einem reversiblen Mode². Obwohl in vielen Fällen nützlich, führt die vollständige Löschung von Genen oder Proteinen in-vivo Letalität^4,5,6. Ebenso gewebespezifischen, bedingte Löschung einiger Gene oder Proteine mit dem Cre/Lox-System einfach, möglicherweise nicht da es letztlich zu den dauerhaften Verlust von kritischen genomische Elemente⁷führt. Daher, je nach gen oder POI, keiner dieser Ansätze werden wirksam bei der Bereitstellung eines nützlichen Modells für nachfolgende Studien, besonders Gene oder Proteine funktionellen Studien in den späten postnatale und Erwachsenen Mäusen.

Zur Umgehung der Probleme im Zusammenhang mit solchen Ansätzen und Proof of Principle über die Wirksamkeit des vorgeschlagenen Verfahrens, möchten wir hier durch die Erzeugung einer bedingten DN-Version des Proteins Retinoblastom 1 (RB1) vorgestellte Methode zu testen. Mehrere Möglichkeiten wurden vorgeschlagenen^8,9,10 , die Funktion des endogenen RB1 abzuschaffen; jedoch alle den gleichen Einschränkungen oben diskutierten konfrontiert: permanente Keimbahn Löschung von RB1 ist Hochkultur tödlich, und mit seinen Tumorsuppressor Rolle, permanente RB1 bedingte Löschung führt zu einer Vielzahl von Tumoren¹¹. Obwohl eine DN-Version von RB1 nicht natürlich vorkommen scheint, sollte eine bessere Alternative zu den derzeit verfügbaren Strategien erlauben eine zeitlich gesteuerte Inaktivierung von endogenen RB1 und bieten einen alternativen Mechanismus schließlich wiederherstellen ihrer Funktion. Die Grundlage für ein solches Konstrukt wurde vor über zwei Jahrzehnten beschrieben¹. Allerdings fehlte es aufgrund von technischen Einschränkungen, einen Mechanismus zur Kontrolle Transgen Aktivierung, Reaktion und Gewebespezifität. Diese Studie ist die erste verbinden die Eleganz der Doxycyclin (Dox)-abhängige transkriptionelle System mit ein veränderter transgenen Konstrukt der lysosomalen Protease CB und Rb1 Proteine. Die daraus resultierende CBRb-Maus-Modell ermöglicht eine vorübergehend geregelten Dox-vermittelten RB1 Verordnung². Der Vorteil der Verwendung eines Proteom-basierten Ansatzes Genfunktion zu studieren ist, dass es für jedes Gen von Interesse, mit minimalen Informationen über seine Tätigkeit angenommen werden kann.

Die vorgeschlagene DN-Transgen-Strategie bietet viele Vorteile gegenüber herkömmlichen Ansätzen. Erstens führt DN Protein Hemmung zu nur ein teilweiser Ablation Proteinaktivität, um ein passives endogenen Ausdruck. Ein solches Ergebnis ist höchst wünschenswert, in Situationen, wo eine vollständige Beseitigung der Proteinaktivität zu embryonalen Tödlichkeit führt, stark begrenzen jeder Untersuchung um Genfunktion in einer live Maus zu untersuchen. Zweitens ermöglicht die Präsenz des Systems der TetO Transgen Aktivierung nur in Anwesenheit eines Antibiotikums, die für eine effiziente und reversible Kontrolle der Transgen-Aktivität ermöglicht. So durch Beendigung der Antibiotika-Administration, die transgenen System kann deaktiviert werden, und ein normaler RB1 Ausdruck ist wieder an Ihrem Platz. Drittens kann der Veranstalter der Wahl die Spezifität des Transgens Ausdrucks abhängig. Während wir die allgegenwärtigen ROSA-CAG-Promoter für Proof of Principle gewählt haben, dürfte Platzierung des Transgens unter gewebespezifischen Promoter, Studien über die therapeutische Anwendung von diesem Transgen zu unerwünschten Transgene Ausdruck zu beschränken Methodik.