İndüklenebilir ve tersinir baskın-negatif (DN) Protein inhibisyon
Summary
Burada içinde protein var koşullu olarak ters bir baskın negatif mutant yorum overexpressing tarafından inaktive bir baskın negatif indüklenebilir sistemi geliştirmek için bir iletişim kuralı mevcut.
Abstract
Baskın-negatif (DN) protein inhibisyonu protein işlevi işlemek için güçlü bir yöntemdir ve diğer genom tabanlı yaklaşımlar birkaç avantaj sunar. Örneğin, her ne kadar chimeric ve hedefleme stratejileri yaygın olarak kullanıldığını Cre-LoxP , bu stratejileri (Sızıntılı organizatörü etkinlik, mozaik Cre ifade, vb) iç sınırlamaları önemli ölçüde sınırlı onların uygulama. Ayrıca, birçok endojen genlerin tam silme postnatal hayatta gen işlevini incelemek imkansız hale embryonically, ölümcüldür. Bu sorunları ele almak üzere, biz erken bir genetik mühendisliği protokolü için yapılan önemli değişiklikler ve kısa bir (transgenik) sürüm Rb1 gen lizozomal bir proteaz ile kombine procathepsin B (Rb1 bir DN fare modeli oluşturmak için CB), (CBRb). Lizozomal bir proteaz varlığı nedeniyle, tüm CB-RB1 füzyon protein ve onun etkileşen karmaşık proteasome-aracılı bozulması için yönlendirilir. Ayrıca, tetrasiklin uyarıcı (rtTA) elementini transgenik yapısında varlığını indüklenebilir ve tersinir yönetmelik RB1 protein sağlar. CBRb fare modelindeki her yerde ROSA-CAG Organizatör varlığı nerede RB1 ifade edilir geçici ve tersinir Rb1 gen ablasyon taşımak ve araştırmacılar faaliyete hemen hemen herhangi bir hücreye anlamak için bir kaynak sağlamak için yararlı bir araç yapar.
Introduction
Genellikle tam ortadan kaldırılması veya kesme gen, RNA dizileri veya protein (POI) ilgi neden kalıcı süreçleri, çoğu yaklaşımlar gen ve protein ablations amaçlayan güveniyor. Bu yöntem genel amacı endojen, vahşi tipi proteinin işlev kaldırılması için Rekombinant protein mühendisi etmektir. Biz revisited ve geçici ablasyon poi DN inhibisyonu yoluyla izin veren bir alternatif strateji1,2, revamped. Bu yöntem inşaat için her ikisi multimeric ve monomeric peptidler ama multimeric derlemesinde işlev proteinler için uygundur.
Yöntem bir multimeric POI (CB füzyon karmaşık) bir alt birim için lizozomal proteaz CB eritme oluşur. Sonuç CB füzyon karmaşık ile etkileşim ve proteolytically endojen protein sindirimi veya bozulmuş3olmak lysosome için tüm CB-POI karmaşık aktarma. Ayrıca, CB füzyon karmaşık bir birleşim tetrasiklin kontrollü transkripsiyon harekete geçirmek (TetO) sistem indüklenebilir doğası ile geri dönüşümlü moda2transgene indüklenebilir ve kontrollü bir ifade sağlar. Birçok durumda yararlı olsa da genleri veya proteinler içinde vivo tam silinmesine ölümcül4,5,6‘ neden olabilir. Bu sonuçta, kritik genomik elements7kalıcı kaybına yol açacaktır aynı şekilde, bazı genlerin veya Cre/Lox sistemini kullanarak proteinler doku özgü, koşullu silinmesine basit, olmayabilir. Bu nedenle, gen veya POI bağlı olarak, bu yaklaşımlardan hiçbiri sonraki çalışmaları için uzun bir faydalı model sağlanmasında etkili olacaktır özellikle genler veya protein fonksiyonel çalışmalarda geç Doğum sonrası ve yetişkin mice.
Bu tür yaklaşımlar ile ilgili sorunları aşmak ve sağlamak için ilke kanıt önerilen yöntemin etkinliği üzerine burada koşullu bir DN sürüm Retinoblastom 1 (RB1) protein üreten tarafından sunulan yöntemini sınamanızı sağlamak seçtik. Çeşitli seçenekler endojen RB1 fonksiyonu ortadan kaldırmak için önerilen8,9,10 olmuştur; Ancak, tüm bunların bazı yukarıda açıklanan aynı sınırlamaları karşı karşıya: RB1 silinmesiyle kalıcı germline embryonically öldürücü ve tümör baskılayıcı rolü, kalıcı ile tutarlı RB1 koşullu silme tümörler11çeşitli için yol açar. RB1 bir DN sürümü doğal olarak görünmüyor olsa da, şu anda mevcut stratejileri daha iyi bir alternatiftir endojen RB1 bir geçici kontrollü inactivation için izin ve sonunda geri yüklemek için alternatif bir mekanizmaya onun işlev. Böyle bir yapı için temel üzerinde yirmi yıl önce açıklanan1. Ancak, teknolojik sınırlamalar nedeniyle, denetim transgene harekete geçirmek, yanıt ve doku özgüllük bir mekanizma yoktu. Bu zarafeti doksisiklin (Dox) ile birleştirmek için ilk çalışmadır-bağımlı transkripsiyon sistemi lizozomal proteaz CB ve Rb1 proteinlerin bir mühendislik transgenik inşa ile. Elde edilen CBRb fare modeli için bir geçici olarak düzenlenmiş Dox aracılı RB1 sağlar düzenleme2. Gen işlevini incelemek için böyle bir Proteom tabanlı yaklaşım kullanmanın avantajı bu faaliyet hakkında çok az bilgi ile ilgi herhangi bir gen için kabul edilebilir olduğunu.
Önerilen DN transgene strateji geleneksel yaklaşımlar birçok avantaj sunar. İlk olarak, DN protein inhibisyon sadece kısmi bir ablasyon için böylece bir kalıntı endojen ifade koruyarak protein etkinliği olarak, yol açar. Böyle bir sonuç nereye embriyonik ölümcül, büyük ölçüde sınırlayan bir canlı fare işlevinde gen çalışmaya herhangi bir soruşturma için protein etkinlik tam bir kaldırılması çıktığını durumlarda son derece arzu edilir. İkinci olarak, sadece bir transgene faaliyet verimli ve tersinir denetimi için izin veren bir antibiyotik, huzurunda transgene harekete geçirmek TetO sistemi sağlar. Bu nedenle, antibiyotik yönetim çıkıyordu tarafından transgenik sistem devre dışı bırakılabilir ve normal RB1 ifade geri yerdir. Üçüncü olarak, transgene ifade özgüllük seçim düzenleyici bağlı olarak değişebilir. Her yerde ROSA-CAG organizatörü ilkesi kanıt için seçtik, bir doku özgü organizatörü altında transgene yerleştirerek istenmeyen transgene ifade kısıtlamak ve bu transgene tedavi uygulanması çalışmaları kolaylaştırmak muhtemeldir metodoloji.
Protocol
Representative Results
Discussion
Geleneksel transgenik stratejileri ile ilgili sınırlamaları aşmak için hangi endojen bir POI koşullu olarak bir DN mutant formu kronolojik zamanmekansal bir şekilde overexpressing tarafından inaktive bir fare modeli oluşturmak çalıştı. Endojen İÇN fonksiyonu ortadan kaldırmak için çeşitli seçenekler önerilen15,16,17olmuştur. Bir önceki genetik strateji1 Dox bağımlı transkripsiyon…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
PCS2 + CB-Myc6 vektör Marshall Horwitz (University of Washington, Seattle, WA, ABD) bir hediye oldu. Hee OC1 hücreleri nazikçe Fedrico Kalinec (David Geffen School of Medicine, UCLA, Los Angeles, Kaliforniya, ABD) tarafından temin edilmiştir. Teknik destek UNMC fare genom mühendislik çekirdek (C.B. Gurumurthy, Don Harms, rol Brezilya’lı) ve Creighton Üniversitesi entegre Biyomedikal görüntüleme tesis (Richard Hallworth, John Billheimer) tarafından sağlandı. UNMC fare genom mühendislik NIH/NIGMS, bir Kurumsal Geliştirme Ödülü (fikir) tarafından desteklenen sayı P20 GM103471 verin. Entegre Biyomedikal görüntüleme tesisin Creighton Üniversitesi Tıp ve hibe GM103427 ve GM110768 NIH/NIGMS dan tarafından desteklenmiştir. Tesisin Ulusal Merkezi gelen hibe desteği için araştırma kaynakları (RR016469) ile inşa edilmiştir ve NIGMS (GM103427). Bu çalışmada oluşturulan fare satırları Creighton Üniversitesi’nin hayvan kaynak tesis olan altyapı bir hibe NIH/NCRR G20RR024001 tarafından geliştirildi, muhafaza. Bu eser geçmiş COBRE vermek (Shelley D. Smith ile) bir NIH/NCRR 5P20RR018788-/ NIH/NIGMS 8P20GM103471, NIH/ORIP R21OD019745-01A1 (S.M.R.-S.) ve işitme Sağlık Vakfı (S. Tarang için) bir ortaya çıkan araştırma hibe yoluyla destek aldı. Bu araştırma içeriği yalnızca yazarlar sorumludur ve mutlaka Ulusal Sağlık Enstitüleri resmi görüşlerini temsil etmiyor.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium, DMEM | GIBCO-BRL | 11965-084 | |
| Minimum Essential Medium Eagle, MEME | Sigma | M8042 | |
| Fetal bovine serum | Sigma | F2442 | |
| Lipofectamine | DharmaFECT | T-2010-03 | |
| Sal I | Roche | 11745622 | |
| EcoRV-HF | New England BioLabs | R3195S | |
| NotI | Roche | 13090730 | |
| CaspaTag | Millipore | APT523 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Staurosporine | Sigma | S4400 | |
| CyQuant NF cell proliferation kit | Invitrogen | C35007 | |
| Retinoblastoma 1 antibody | Abcam | Ab6075 | |
| c-Myc antibody | Sigma | M5546 | |
| b-actin | Sigma | A5316 | |
| Ki-67 | Thermofisher scientific | MA5-14520 | |
| Phallodin | Thermofisher scientific | A12379 | |
| Fluorescence microplate reader | FLUOstar OPTIMA, BMG Labtech | ||
| Epifluorescence microscope | NikonEclipse80i | ||
| The TetO-DN-CB-myc6-Rb1 (DN-CBRb) mouse line is available from the Jackson Laboratory as JAX#032011. |
References
- Li, F. Q., et al. Preferential MyoD homodimer formation demonstrated by a general method of dominant negative mutation employing fusion with a lysosomal protease. Journal of Cell Biology. 135 (4), 1043-1057 (1996).
- Tarang, S., et al. Generation of a retinoblastoma (rb)1-inducible dominant-negative (DN) mouse model. Frontiers Cellular Neuroscience. 9 (52), (2015).
- Kominami, E., et al. The selective role of cathepsins B and D in the lysosomal degradation of endogenous and exogenous proteins. FEBS Letters. 287 (1-2), 189-192 (1991).
- Cortellino, S., et al. Defective ciliogenesis, embryonic lethality and severe impairment of the sonic hedgehog pathway caused by inactivation of the mouse complex A intraflagellar transport gene Ift122/Wdr10, partially overlapping with the DNA repair gene Med1/Mbd4. Developmental Biology. 325 (1), 225-237 (2009).
- Ferreira, C., et al. Early embryonic lethality of H ferritin gene deletion in mice. Journal of Biological Chemistry. 275 (5), 3021-3024 (2000).
- Lee, E. Y., et al. Mice deficient for rb are nonviable and show defects in neurogenesis and haematopoiesis. Nature. 359 (6393), 288-294 (1992).
- Turlo, K. A., et al. When cre-mediated recombination in mice does not result in protein loss. Genetics. 186 (3), 959-967 (2010).
- Weber, T., et al. Rapid cell-cycle reentry and cell death after acute inactivation of the retinoblastoma gene product in postnatal cochlear hair cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (2), 781-785 (2008).
- Zhang, J., et al. The first knockout mouse model of retinoblastoma. Cell Cycle. 3 (7), 952-959 (2004).
- Zhao, H., et al. Deletions of retinoblastoma 1 (Rb1) and its repressing target S phase kinase-associated protein 2 (Skp2) are synthetic lethal in mouse embryogenesis. Journal of Biological Chemistry. 291 (19), 10201-10209 (2016).
- Yamasaki, L., et al. Loss of E2F-1 reduces tumorigenesis and extends the lifespan of Rb1(+/-) mice. Nature Genetics. 18 (4), 360-364 (1998).
- Li, F. Q., et al. Selection of a dominant negative retinoblastoma protein (RB) inhibiting satellite myoblast differentiation implies an indirect interaction between MyoD and RB. Molecular and Cellular Biology. 20 (14), 5129-5139 (2000).
- Pitkanen, K., et al. Expression of the human retinoblastoma gene product in mouse fibroblasts: Effects on cell proliferation and susceptibility to transformation. Experimental Cell Research. 207 (1), 99-106 (1993).
- Chano, T., et al. Neuromuscular abundance of RB1CC1 contributes to the non-proliferating enlarged cell phenotype through both RB1 maintenance and TSC1 degradation. International Journal of Molecular Medicine. 18 (3), 425-432 (2006).
- Kole, R., et al. RNA therapeutics: Beyond RNA interference and antisense oligonucleotides. Nature Reviews Drug Discovery. 11 (2), 125-140 (2012).
- Yamamoto, A., et al. The ons and offs of inducible transgenic technology: A review. Neurobiology of Disease. 8 (6), 923-932 (2001).
- Houdebine, L. M., et al. Transgenic animal models in biomedical research. Methods in Molecular Biology. 360, 163-202 (2007).
- Brehm, A., et al. Retinoblastoma protein recruits histone deacetylase to repress transcription. Nature. 391 (6667), 597-601 (1998).
- Lu, Z., et al. E2F-HDAC complexes negatively regulate the tumor suppressor gene ARHI in breast cancer. Oncogene. 25 (2), 230-239 (2006).
- Magnaghi-Jaulin, L., et al. Retinoblastoma protein represses transcription by recruiting a histone deacetylase. Nature. 391 (6667), 601-605 (1998).
