Inibição de proteína inducible e reversível dominante-negativo (DN)

A maioria das abordagens visando os gene e proteína ablações dependem de processos de permanentes, que geralmente levam à eliminação completa ou truncamento do gene, sequências de RNA ou proteína de interesse (POI). O objetivo geral deste método é engenheiro uma proteína recombinante para suprimir a função da proteína endógena, selvagem-tipo. Nós temos revisitado e renovada uma estratégia alternativa^1,2, que permite a ablação temporária de um POI através da inibição de DN. Esse método funciona para ambos multiméricas e peptídeos monoméricos, mas é o mais adequado para as proteínas que funcionam em um assembly multiméricas.

O método consiste em fundir a protease lisossômica CB para uma subunidade de uma multiméricas POI (fusão de CB complexo). A fusão de CB resultante complexa pode interagir com e proteoliticamente digerir a proteína endógena ou desviar todo o complexo para o lisossoma para ser degradada³CB-POI. Além disso, uma combinação da fusão CB complexa com a natureza inducible do sistema controlado por tetraciclina ativação transcricional (TetO) permite uma expressão inducible e controlada do transgene em uma moda reversível². Embora útil em muitas circunstâncias, a completa eliminação de genes ou proteínas in vivo pode resultar em letalidade^4,5,6. Da mesma forma, exclusão condicional, tecido-específica de alguns genes ou proteínas utilizando o sistema Cre/Lox pode não ser simples, como, em última análise, conduzirá à perda permanente de elementos críticos de genômica⁷. Portanto, dependendo do gene ou POI, nenhuma dessas abordagens será eficaz em fornecer um modelo útil para estudos posteriores, particularmente dos genes ou dos proteínas estudos funcionais em camundongos adultos e pós-natal atrasados.

Para contornar os problemas associados com tais abordagens e fornecer prova de princípio sobre a eficácia do método proposto, decidimos testar o método apresentado aqui, gerando uma versão DN condicional da proteína do Retinoblastoma 1 (RB1). Várias opções foram propostos^8,9,10 para abolir a função de RB1 endógena; no entanto, todos eles enfrentaram algumas das mesmas limitações discutidas acima: exclusão permanente germline de RB1 é embryonically letal, e, coerente com seu papel de supressor de tumor, permanente exclusão condicional RB1 leva a uma variedade de tumores¹¹. Apesar de uma versão do DN de RB1 não parece ocorrer naturalmente, uma alternativa melhor para as estratégias atualmente disponíveis deve permitir uma inativação temporalmente controlada do RB1 endógena e fornecem um mecanismo alternativo para eventualmente restaurar sua função. A base para tal uma construção foi descrita há mais de duas décadas atrás¹. No entanto, devido às limitações tecnológicas, faltava-lhe um mecanismo de controle do transgene ativação de resposta e especificidade de tecido. Este estudo é o primeiro a combinar a elegância de doxiciclina (Dox)-sistema transcriptional dependente com uma engenharia construção transgênica de protease lisossômica CB e Rb1 proteínas. O modelo resultante do rato CBRb permite um temporariamente regulamentado RB1 mediada por Dox regra². A vantagem de usar uma abordagem baseada em proteoma para estudar a função dos genes é que pode ser adotado para qualquer gene de interesse, com informações mínimas sobre a sua actividade.

A estratégia proposta do transgene DN oferece muitas vantagens sobre as abordagens tradicionais. Primeiro, inibição da proteína de DN leva a apenas uma ablação parcial na atividade da proteína, preservando assim uma expressão residual endógena. Esse resultado é altamente desejável em situações onde uma eliminação completa da atividade da proteína leva a letalidade embrionária, limitando grandemente qualquer investigação para estudar a função do gene em um rato vivo. Em segundo lugar, a presença do sistema de TetO permite ativação do transgene apenas na presença de um antibiótico, o que permite um controle eficiente e reversível da atividade do transgene. Assim, por cessar a administração de antibióticos, o sistema transgênico pode ser desativado, e uma expressão normal de RB1 está de volta em casa. Em terceiro lugar, a especificidade da expressão do transgene pode variar dependendo do promotor da escolha. Enquanto nós escolhemos o promotor ROSA-CAG onipresente para prova de princípio, colocar o transgene sob um promotor de tecido-específica é susceptível de restringir a expressão do transgene indesejados e facilitar estudos sobre a aplicação terapêutica deste transgene metodologia.