誘導およびリバーシブルのドミナント ネガティブ (DN) 蛋白質の阻害

遺伝子および蛋白質の試練を目指すほとんどのアプローチは、一般的に完全な除去や遺伝子、rna、または興味 (POI) の蛋白質の切り捨てにつながる永続的なプロセスに依存します。このメソッドの全体的な目標は、内因性、野生型タンパク質の機能を廃止する組換え蛋白質をエンジニア リングすることです。再訪し、DN の抑制を介してポイの一時的なアブレーションは、代替戦略^1,2を刷新しました。このメソッドは、ポリコームタンパクと単量体ペプチドの両方のために働くが、ポリコームタンパク アセンブリ内で機能する蛋白質に最適です。

メソッドは、溶断ポリコームタンパク ポイ (CB 融合タンパク複合体) のサブユニットにライソゾーム プロテアーゼ CB で構成されます。複雑な結果の CB の融合との対話し生内因性のタンパク質を消化したり劣化³リソソームに全体の CB-POI の複合体をそらします。また、テトラサイクリン制御転写活性化 (重音テト) 系の誘導の自然と、CB 融合タンパク複合体の組み合わせは、リバーシブル ファッション²遺伝子の誘導と制御式にできます。多くの状況で有用遺伝子または蛋白質の生体内での完全な削除は致死率^4,5,6で起因できます。同様に、それは最終的には、重要なゲノムの要素⁷の永久的な損失につながるのいくつかの遺伝子または蛋白質 Cre/Lox システムを使用して組織に固有の条件付きの削除は簡単にできません。したがって、遺伝子や POI によってこれらのアプローチのどちらも有効であるその後の研究のための有用なモデルを提供する特に遺伝子または蛋白質の後半の産後と大人のマウスの機能の研究。

提案手法の有効性に関する証拠の原則そのようなアプローチに関連する問題を回避し、提供、我々 は網膜芽細胞腫 1 (RB1) 蛋白質の条件付き DN バージョンを生成することによって、ここで紹介する方法をテストする分野します。いくつかのオプションは、内因性 RB1 の機能を廃止する提案^8,9,10をされています。しかし、それらのすべての上記で説明した同じ制限に直面: RB1 の永久的な生殖削除は強肩致死、その腫瘍サプレッサーの役割と永続的な一貫性のある RB1 条件付き削除へとつながって様々 な腫瘍¹¹。にもかかわらず、RB1 の DN バージョンは、自然に発生するとは思えない、現在利用可能な戦略をより良い代替手段が内因性の RB1 の一時的に制御された不活性化を可能にする、最終的に復元する別のメカニズムを提供する、関数。そのような構築のための基礎は前に二十年以上に述べた¹。ただし、技術的な制限のためには組織特異性、応答制御遺伝子の活性化機構を欠けていた。本研究ではドキシサイクリン (Dox) の優雅を結合する最初のライソゾーム プロテアーゼ CB とRb1蛋白質の組み換え遺伝子組換えコンストラクト依存転写システム。結果の CBRb マウス モデルは、一時的に規制 Dox を介した RB1 規制²。プロテオーム ベースのアプローチを使用して遺伝子の働きを研究するの利点は、それがその活動を最小限の情報で関心の任意の遺伝子が採用されることがあります。

DN 遺伝子手法では、従来の方法に比べて多くの利点を提供しています。まず、DN タンパク質阻害は蛋白質の活動、したがって残留内因性表現を維持にのみ部分的なアブレーションに します。そのような結果は蛋白質の活動の完全な除去が胚性致死率は、大きく生きているマウスの遺伝子の機能を研究する任意の調査を制限することにつながるような状況で非常に望ましい。第二に、重音テト システムの存在は、遺伝子活動の効率的かつ可逆的な制御が可能の抗生物質の存在下でのみ遺伝子活性化できます。したがって、抗菌薬の投与を中止、形質転換システムは非アクティブにできますと通常の RB1 式は元の場所に。第三に、導入遺伝子発現の特異性は、任意のプロモーターによって異なります。原理実証のためのユビキタス ローザ CAG プロモーターをいただいて、組織固有のプロモーター遺伝子を配置することは不要な遺伝子発現を制限し、この遺伝子治療への応用に関する研究を促進する可能性が高い方法論。