Inhibición de la proteína inducible y Reversible dominante negativo (DN)

Enfoques más con el objetivo de la ablación del gen y la proteína dependen de procesos permanentes, que generalmente conducen a la eliminación completa o el truncamiento de la gene, secuencias de ARN o proteínas de interés (POI). El objetivo general de este método es diseñar una proteína recombinante para suprimir la función de la proteína endógena, tipo salvaje. Hemos revisado y renovado una estrategia alternativa^1,2, que permite la ablación temporal de un POI a través de la inhibición de la DN. Este método funciona para multiméricas y péptidos monoméricos pero es el más adecuado para las proteínas que funcionan en una Asamblea de multimérica.

El método consiste en fundir la proteasa lisosomal CB a una subunidad de un multimérica POI (complejo de fusión de la CB). La fusión resultante de CB complejo puede interactuar con proteolytically digerir la proteína endógena y desviar todo el complejo de POI CB al lisosoma para ser degradados³. Por otra parte, una combinación de la fusión de CB compleja con el carácter inducible del sistema de activación transcripcional controlado por tetraciclina (TetO) permite una expresión inducible y controlada del transgén en una manera reversible². Aunque útil en muchas circunstancias, la supresión completa de genes o proteínas in vivo puede resultar en mortalidad^4,5,6. Además, eliminación de tejidos específicos, condicional de algunos genes o proteínas mediante el sistema Cre/Lox puede no ser sencillo, ya que provocaría, en última instancia, a la pérdida permanente de elementos genómicos críticos⁷. Por lo tanto, dependiendo de la genética o POI, ninguno de estos enfoques será eficaz en proporcionar un modelo útil para estudios posteriores, particularmente genes o proteínas los estudios funcionales en ratones adultos y postnatales tardíos.

Para eludir los problemas asociados con estos enfoques y proporcionar prueba de principio sobre la efectividad del método propuesto, hemos optado por probar el método presentado aquí por generar una versión DN condicional de la proteína Retinoblastoma 1 (RB1). Varias opciones han sido propuestos^8,9,10 para suprimir la función de RB1 endógeno; sin embargo, todos ellos frente a algunas de las mismas limitaciones mencionadas: eliminación permanente del germline de RB1 es catequizador letal y, coherente con su función de supresor de tumor, permanente borrado condicional RB1 conduce a una variedad de tumores¹¹. Aunque una versión de DN de RB1 parece no ocurre naturalmente, una mejor alternativa a las estrategias actualmente disponibles debe permitir una inactivación temporal controlada de RB1 endógeno y proporcionar un mecanismo alternativo para finalmente restaurar su función. La base para dicha construcción fue descrita hace más de dos décadas¹. Sin embargo, debido a limitaciones tecnológicas, carecía de un mecanismo de control transgen activación, la respuesta y la especificidad de tejido. Este estudio es el primero en combinar la elegancia de la doxiciclina (Dox)-sistema transcripcional dependiente con una construcción transgénica ingeniería de proteínas de CB y Rb1 proteasa lisosomal. El modelo de ratón de CBRb resultante permite una RB1 mediada por Dox temporalmente regulada regulación². La ventaja de utilizar un enfoque basado en el proteoma para estudiar la función genética es que puede adoptarse para cualquier gen de interés, con la mínima información sobre su actividad.

La estrategia propuesta de transgen DN ofrece muchas ventajas sobre los enfoques tradicionales. En primer lugar, inhibición de la proteína DN conduce a solamente una ablación parcial en actividad de la proteína, preservando así una expresión endógena residual. Ese resultado es muy conveniente en situaciones donde una eliminación completa de la actividad de la proteína conduce a mortalidad embrionaria, limitando grandemente cualquier investigación para estudiar la función del gen en un ratón vivo. En segundo lugar, la presencia del sistema TetO permite activación de transgen sólo en presencia de un antibiótico, que permite un control eficaz y reversible de la actividad del transgen. Así, al dejar la administración de antibióticos, se puede desactivar el sistema de transgénico, y es una expresión normal de RB1 en lugar. En tercer lugar, la especificidad de la expresión del transgen puede variar según el promotor de la opción. Aunque hemos optado por el promotor de ROSA-CAG ubicuo para la prueba de principio, colocar el transgén en un promotor tejido específico es probable restringir la expresión del transgén no deseados y facilitar estudios sobre la aplicación terapéutica de este transgén metodología.