Afleidbare en omkeerbare Dominant-negatief (DN) eiwit remming

Meeste benaderingen die gericht zijn op de gen- en eiwit ablations is afhankelijk van permanente processen, die over het algemeen tot de volledige uitbanning of afkappen van het gen, RNA opeenvolgingen of proteïne van belang (POI leiden). Het algemene doel van deze methode is om ingenieur een recombinant eiwit te schaffen van de functie van endogene, wild-type eiwit. Wij hebben revisited en vernieuwde een alternatieve strategie^1,2, dat voorziet in de tijdelijke ablatie van een POI via DN remming. Deze methode werkt voor zowel multimeric als monomeer peptiden, maar is het meest geschikt voor de eiwitten die in een vergadering van de multimeric functioneren.

De methode bestaat uit het smelten van de lysosomale protease CB aan een subeenheid van een multimeric POI (CB smelting complexe). De resulterende CB fusie complexe kan communiceren met en proteolytically de endogene eiwit verteren of afleiden van het gehele complex van het CB-POI op het lysosoom als aangetaste³. Een combinatie van de complexe CB-fusie met de afleidbare aard van het tetracycline-gecontroleerde transcriptionele (TetO) activeringssysteem voorziet bovendien in een afleidbare en beheerste expressie van de transgenic in een omkeerbare mode². Hoewel het nuttig in veel gevallen, kan de volledige schrapping van genen of eiwitten in vivo resulteren in letaliteit^4,5,6. Ook weefsel-specifieke, voorwaardelijke schrapping van sommige genen of eiwitten met behulp van de Cre/Lox systeem mogelijk niet eenvoudig, zoals het uiteindelijk tot permanent verlies van kritieke genomic elements^{7 leiden zal}. Daarom, afhankelijk van het gen of POI, zal geen van deze benaderingen zijn efficiënt in het verstrekken van een nuttig model voor latere studies, met name genen of eiwitten functionele studies in late postnatale en volwassen muizen.

Te omzeilen van de problemen in verband met een dergelijke aanpak en verstrekken bewijs-van-beginsel op de effectiviteit van de voorgestelde methode, die wij hebben gekozen voor het testen van de methode die hier wordt gepresenteerd door het genereren van een voorwaardelijke DN-versie van de proteïne Retinoblastoom 1 (RB1). Verschillende opties zijn voorgestelde^8,9,10 tot afschaffing van de functie van endogene RB1; echter allemaal geconfronteerd enkele van dezelfde beperkingen hierboven besproken: permanente germline schrapping van RB1 is embryonically dodelijk en, conform haar tumor suppressor rol, permanente RB1 voorwaardelijke schrapping leidt tot een verscheidenheid van tumoren¹¹. Hoewel een DN versie van RB1 niet van nature lijkt, een beter alternatief voor de momenteel beschikbare strategieën moet voorzien in een stoffelijk gecontroleerde inactivatie van de endogene RB1 en bieden een alternatief mechanisme te herstellen uiteindelijk haar functie. De basis voor een dergelijke constructie werd meer dan twee decennia geleden beschreven¹. Echter, als gevolg van technologische beperkingen het ontbrak een mechanisme voor controle transgenic activering, reactie en weefsel specificiteit. Deze studie is de eerste te combineren de elegantie van de doxycycline (Dox)-afhankelijke transcriptionele systeem met een gemanipuleerde transgene constructie van lysosomale protease CB en Rb1 eiwitten. De resulterende CBRb muismodel zorgt voor een tijdelijk gereglementeerde Dox-gemedieerde RB1 voorschrift². Het voordeel van het gebruik van een dergelijke Proteoom gebaseerde aanpak om te studeren van genfuncties is dat het voor elke gen van belang, met minimale informatie over haar activiteiten kan worden aangenomen.

De voorgestelde DN transgenic strategie biedt vele voordelen ten opzichte van de traditionele benaderingen. Eerst, DN eiwit remming leidt tot slechts een gedeeltelijke ablatie eiwit activiteit, dus het behoud van een residuele endogene expressie. Zo’n resultaat is zeer wenselijk in situaties waar een volledige eliminatie van eiwit activiteit tot embryonale letaliteit leidt, een onderzoek om te bestuderen van de genfunctie in een levende muis sterk te beperken. Ten tweede, de aanwezigheid van het TetO systeem kunt transgenic activering alleen in aanwezigheid van een antibioticum, dat voor een efficiënte en omkeerbare controle van de transgenic activiteit zorgt. Dus, door op te houden de antibiotica administratie, de transgene systeem kan worden gedeactiveerd, en een normale RB1 expressie is terug op zijn plaats. Ten derde, de specificiteit van de transgenic expressie kan variëren naargelang de promotor van keuze. Terwijl wij hebben besloten de alomtegenwoordige ROSA-CAG-promotor voor bewijs-van-principe, is plaatsen de transgenic onder een weefsel-specifieke promotor waarschijnlijk tot beperking van ongewenste transgenic expressie en vergemakkelijken van studies over de therapeutische toepassing van deze transgenic methodologie.