تثبيط البروتين إيندوسيبلي وعكسها المهيمنة سالب (DN)

معظم النهج الرامية إلى أبلاتيونس الجينات والبروتين تعتمد على العمليات الدائمة، التي تؤدي عموما إلى القضاء التام على أو اقتطاع الجينات، وتسلسل الحمض النووي الريبي أو البروتين من الاهتمام (POI). والهدف العام لهذا الأسلوب مهندس بروتين المؤتلف بإلغاء وظيفة البروتين الذاتية، والبرية من نوع. قمنا بإعادة النظر وتجديده استراتيجية بديلة^1،2، والذي يسمح للاجتثاث المؤقتة البوي عن طريق تثبيط DN. هذا الأسلوب يعمل لكل من مولتيميريك والببتيدات أحادي ولكن هو الأنسب للبروتينات التي تعمل في جمعية مولتيميريك.

الأسلوب الذي يتكون من الصمامات حوزتي الليزوزومية CB لوحدة فرعية من مولتيميريك البوي (CB الانصهار المعقدة). الانصهار CB الناتجة معقدة يمكن أن تتفاعل مع وبروتيوليتيكالي هضم البروتين الذاتية أو تحويل المجمع بأكمله البوي CB إلى يحلول أن يكون المتدهورة³. وعلاوة على ذلك، مزيج من الانصهار CB المعقدة مع الطابع إيندوسيبلي لنظام التنشيط النسخي تسيطر عليها التتراسيكلين (تيتو) يسمح لتعبير إيندوسيبلي والتي تسيطر عليها من التحوير في أزياء عكسها². على الرغم من أن مفيد في العديد من الحالات، يمكن أن يؤدي الحذف الكامل للجينات أو البروتينات المجراة في الفتك^4،،من⁵⁶. وبالمثل، الحذف الخاصة بالانسجة، والشرطي لبعض الجينات أو البروتينات باستخدام نظام لوكس Cre/قد لا تكون واضحة، كما أنه، في نهاية المطاف، سيؤدي إلى خسارة دائمة للعناصر الجينية الحاسمة⁷. ولذلك، اعتماداً على الجينات أو البوي، أيا من هذه النهج سيكون من فعالية في تقدم نموذجا مفيداً للدراسات اللاحقة، لا سيما الجينات أو البروتينات الدراسات الفنية في الفئران بعد الولادة والكبار أواخر.

للالتفاف على المشاكل المرتبطة بهذه النهج وتقديم إثبات لمبدأ فعالية الطريقة المقترحة، اخترنا لاختبار الأسلوب الذي قدمه هنا توليد نسخة DN شرطي من البروتين الشبكية 1 (RB1). وكانت العديد من الخيارات المقترحة^8،،من⁹¹⁰ إلى إلغاء وظيفة RB1 الذاتية؛ لكن كل منهم تواجه بعض القيود نفسها المذكورة أعلاه: حذف الخط الدائم RB1 شأن الفتاكة، والحذف الشرطي RB1 تمشيا مع دورها القامع الورم، دائم يؤدي إلى مجموعة متنوعة من الأورام¹¹. على الرغم من أن إصدار DN من RB1 لا يبدو أن يحدث بطبيعة الحال، أفضل بديل للاستراتيجيات المتاحة حاليا ينبغي أن تسمح المنظمة التي تسيطر عليها وقتيا من RB1 الذاتية وتوفير إليه بديلة في نهاية المطاف إعادة لها الدالة. ووصفت أساسا لتركيبة من هذا القبيل منذ أكثر من عقدين من الزمان¹. ومع ذلك، بسبب القيود التكنولوجية، أنها تفتقر إلى إليه لمراقبة التحوير التنشيط واستجابة، وخصوصية النسيج. وهذه الدراسة هي الأول من الجمع بين أناقة الدوكسي (دوكس)-يعتمد النظام النسخي مع مقولة أساسية المعدلة وراثيا هندسيا من بروتينات سي بي و Rb1 البروتياز الليزوزومية. نموذج كبرب الناتجة على الماوس يسمح RB1 دوكس بوساطة مؤقتاً ينظم البند². وميزة استخدام هذا نهج القائم على البروتين لدراسة وظيفة الجينات أن يتم اعتماده للجينات أي اهتمام، مع الحد الأدنى من المعلومات عن نشاطه.

الاستراتيجية المقترحة للتحوير DN يوفر مزايا عديدة أكثر من النهج التقليدي. أولاً، يؤدي تثبيط البروتين DN إلى إلا الاستئصال الجزئي في نشاط البروتين، وبالتالي الحفاظ على تعبير ذاتية متبقية. هذه نتيجة مرغوب فيه للغاية في الحالات التي يؤدي فيها القضاء تام على نشاط البروتين إلى الفتك الجنينية، تحد إلى حد كبير أي تحقيق لدراسة وظيفة الجينات في ماوس حية. ثانيا، وجود نظام تيتو تمكين التنشيط التحوير إلا بوجود المضادات الحيوية، مما يسمح لعنصر الكفاءة و عكسها على نشاط التحوير. وهكذا، بالتوقف الصادات، يمكن إلغاء تنشيط النظام المحورة وراثيا، وتعبير RB1 عادي مرة أخرى في المكان. ثالثا، يمكن أن تختلف خصوصية التعبير التحوير اعتماداً على المروج للاختيار. في حين أننا اخترنا المروج روزا-المساعدة النقدية في كل مكان للإثبات للمبدأ، وضع التحوير تحت مروج الأنسجة على حدة من المرجح أن تقييد التعبير التحوير غير المرغوب فيها وتسهيل الدراسات المتعلقة بتطبيق هذا التحوير العلاجية منهجية.