Ингибирование белков индуцибельной и обратимым Доминант отрицательной (DN)

Большинство подходов, направленных на генов и белков аблаций полагаются на постоянные процессы, которые обычно приводят к полной ликвидации или усечение гена, РНК последовательности или протеин интереса (POI). Общая цель этого метода является инженер рекомбинантных белков отменить функцию эндогенные, одичал тип протеина. У нас пересмотреть и обновленный альтернативная стратегия^1,2, который позволяет для временного абляции POI через ингибитирование DN. Этот метод работает для multimeric и мономерных пептидов, но лучше всего подходит для белков, которые функционируют в сборке multimeric.

Этот метод состоит из фьюзинга лизосомальных протеазы CB для субблока multimeric Пои (CB фьюжн комплекс). Результирующая CB фьюжн комплекс может взаимодействовать с и proteolytically дайджест эндогенного белка или отвлекать весь комплекс CB-Пои для Лизосома деградированных³. Кроме того сочетание CB фьюжн комплекс с индуцибельной характер системы контролируемой тетрациклин transcriptional активации (Тето) позволяет выражение индуцибельной и контролируемых трансген в реверсивные мода². Хотя полезно во многих случаях, полное исключение генов или белков в естественных условиях может привести к летальность^4,5,6. Аналогичным образом ткани конкретным, условного удаления некоторых генов или белки, с использованием системы Cre/Lox не может быть простым, как это в конечном счете, приведет к постоянной потере критических геномной элементы⁷. Таким образом, в зависимости от гена или POI, ни один из этих подходов будет эффективным в предоставлении полезной моделью для последующих исследований, особенно генов или белки функциональных исследований в конце послеродового и взрослых мышей.

Чтобы обойти проблемы, связанные с такими подходами и обеспечить доказательство принципа эффективности предложенного метода, мы выбрали для тестирования метода, представленные здесь, создавая условный DN версию белка ретинобластомы 1 (RB1). Несколько вариантов были предлагаемые^8,9,10 отменить функцию эндогенного RB1; Однако, все они сталкиваются некоторые из те же ограничения, обсуждавшиеся выше: исключить постоянное микрофлорой RB1 embryonically смертельной, и, в соответствии с его опухоль подавитель роль, постоянного RB1 условного удаления приводит к различных опухолей¹¹. Даже несмотря на то, что версия DN RB1, как представляется, не происходят естественно, лучшей альтернативы для имеющихся в настоящее время стратегии позволяют временно контролируемых инактивации эндогенного RB1 и предоставить альтернативный механизм в конечном итоге восстановить ее функция. Основой для такой конструкции был описан более двух десятилетий назад¹. Однако из-за технологических ограничений, это не механизм для активации управления трансген, ответ и специфика ткани. Это исследование является первым, чтобы совместить элегантность доксициклин (Dox)-зависимых транскрипционный анализ системы с конструкцией инженерии трансгенных лизосомальных протеазы CB и Rb1 белков. Полученная в результате модель мыши НАСВВП позволяет временно регулируемых Dox опосредованной RB1 правила². Преимущество использования такого подхода, основанного на протеома для изучения функции гена является, что он может быть принят для любого гена интереса, с минимальной информации о своей деятельности.

Предлагаемая стратегия трансген DN имеет много преимуществ над традиционными подходами. Во-первых DN белка ингибирование приводит к только частичное абляции активности белка, таким образом, сохраняя остаточного эндогенного выражение. Такой результат является весьма желательным в ситуациях, где полная ликвидация деятельности белка приводит к эмбриональной летальность, значительно ограничивает любое расследование для изучения функции гена в живой мыши. Во-вторых наличие системы Тето позволяет трансген активации только в присутствии антибиотик, который позволяет для эффективной и обратимым контроль деятельности трансген. Таким образом путем прекращения антибиотиков, трансгенных система может быть отключена, и нормальное выражение RB1 обратно на место. В-третьих специфика трансген выражение может варьироваться в зависимости от промоутера выбора. В то время как мы выбрали вездесущие Роза-CAG промоутер для доказательства в принципе, поместив трансген под ткани конкретной промоутера, скорее всего ограничить нежелательные трансген выражение и облегчения исследования терапевтического применения этой трансген методология.