Estandarización de un novedoso software semiautomático para la medición del crecimiento de neuritas

En los nervios ciáticos, es posible medir la regeneración axonal¹. Además, estudios in vitro han demostrado la viabilidad de monitorizar el crecimiento axonal ^2,3 para comprender sus diversas fases, desde la brotación axonal hasta la degeneración axonal, tanto en neuronas sanas como lesionadas. Mediante el seguimiento de estos procesos, es posible medir parámetros como la polaridad axonal, la iniciación, la estabilidad y la ramificación. Este último parámetro es crucial para entender la percepción del dolor neuropático ^4,5,6. Del mismo modo, la degeneración axonal puede ser monitorizada in vivo⁷ o in vitro ^8,9. Durante el crecimiento de las neuritas, las redes de citoesqueletos de actina y microtúbulos se estabilizan o cambian de acuerdo con las necesidades de la célula¹⁰. El citoesqueleto de actina se reorganiza para permitir la formación del cono de crecimiento axonal, y los microtúbulos se realinean en haces para estabilizar la neurita en crecimiento¹¹. Con el fin de estudiar el crecimiento de las neuronas centrales y periféricas in vitro, se cuantifican tres parámetros comunes: longitud axonal total, distancia máxima y puntos de ramificación. Estos parámetros se utilizan para estudiar la respuesta de crecimiento neuronal al tratamiento (i.e., neurotrofinas, compuestos, inhibidores, ácido retinoico, siRNA, shRNA) o en animales modificados genéticamente 12,13,14. Para evaluar si las neuronas tienen neuritas más alargadas y/o más ramificadas, estos tres parámetros permiten evaluar la morfología de una neurona. La medición de la longitud de las neuritas es el parámetro de mayor interés en varios montajes experimentales in vitro. A partir de los ganglios de la raíz dorsal, se realizan principalmente dos tipos de cultivos: cultivo in vitro disociado o cultivo organotípico de explantes enteros de DRG. En cualquier caso, la longitud de la neurita es un parámetro de oro para evaluar el resultado del experimento. En una línea celular similar a una neurona motora (NSC-34), se mide el crecimiento axonal y la ramificación después de la diferenciación inducida por el ácido retinoico^15,16. De hecho, al medir el crecimiento de las neuritas, es posible determinar si un tratamiento específico ha funcionado¹⁷, la tasa de crecimiento¹⁸ o la capacidad de regeneración después de un procedimiento de lesión¹⁹.

La forma de evaluar adecuadamente el crecimiento de las neuritas ha planteado un número significativo de desafíos a lo largo de los años en el campo de la investigación. Sin embargo, no existe una estandarización de las mediciones de la longitud de las neuritas. Algunos de los métodos más utilizados para el cultivo celular in vitro son, por ejemplo, el plug-in manual NeuronJ en Fiji^18,20 o MetaMorph^21,23 y el semiautomático Neurolucida^23,24. Además de las metodologías manuales, también existen métodos automáticos, como el plug-in NeuriteTracer en Fiji²⁵, el software HCA Vision^26,27 o WIS-NeuroMath ^2,28. Otras metodologías menos precisas se basan en la medición de la dimensión general de las neuronas. Estos métodos incluyen la medición de la distancia vectorial desde el cuerpo de la célula hasta la punta del axón^{más largo 29} o el análisis de Sholl³⁰. Sin embargo, estos métodos de medición son adecuados para cultivos de muy baja densidad o neuronas individuales. Además, todas estas metodologías se utilizan principalmente en neuronas teñidas o neuronas que expresan fluoróforos codificados genéticamente (es decir, GFP, Venus, mCherry). El tipo de neurona y la densidad del cultivo celular afectan profundamente a la elección de la metodología de medición. Por ejemplo, segmentar manualmente neuronas con morfologías muy intrincadas y complicadas, como las neuronas DRG, puede convertirse fácilmente en una tarea imposible. Si las neuronas enrevesadas ya son un desafío para segmentar, las redes neuronales están completamente fuera del alcance de los enfoques manuales debido a su organización altamente compleja.

Por un lado, la segmentación manual es muy precisa porque la realizan los ojos y la inteligencia humanos; Por otro lado, lleva mucho tiempo. El elevado gasto de tiempo requerido por los métodos manuales es el principal inconveniente. Por esta razón, solo se adquieren unas pocas neuronas para el análisis, lo que lo hace menos preciso y costoso en términos de tiempo. Los enfoques automáticos o semiautomáticos, por otro lado, reducen parcialmente el gasto de tiempo. Sin embargo, también tienen algunas desventajas. Los métodos automáticos necesitan ser entrenados para que funcionen correctamente, y si el software no es lo suficientemente interactivo con el usuario, la segmentación puede ser incorrecta.

Además de la medición del crecimiento de neuritas, el número de puntos de ramificación también es información valiosa. Con la segmentación manual, se puede calcular el número de puntos de bifurcación, mientras que esto no es posible con una distancia vectorial. Con los métodos automáticos, generalmente se proporciona el número de puntos de bifurcación, mientras que con el análisis de Sholl, debe calcularse con una fórmula matemática.

En este artículo de métodos, nuestro objetivo es describir la funcionalidad y efectividad de este software semiautomático en la medición de la longitud axonal total y otros parámetros. La máquina permite la adquisición automática de imágenes en puntos de tiempo definidos o para la realización de estudios a largo plazo (días, semanas, meses), preservando un entorno fisiológico para las células vivas. La medición del crecimiento de las neuritas mediante imágenes de lapso de tiempo de contraste de fase tiene la ventaja de permitir un monitoreo continuo de la cinética y el crecimiento de las neuritas. Además, también es posible monitorear la muerte celular a través de la adición en los medios de colorantes específicos que se dirigen a las células muertas 31,32,33. Aunque el software se lanzó en 2012, somos los primeros en estandarizar esta metodología de forma reproducible e imparcial para la cuantificación precisa del crecimiento de neuritas. Sin embargo, es importante tener en cuenta que el software no está incluido con la compra de la máquina. A pesar de este gasto adicional, su uso ofrece ventajas significativas en la medición de la longitud axonal total y otros parámetros, contribuyendo así a la investigación en el campo de la neurociencia.