סטנדרטיזציה של תוכנה חצי-אוטומטית חדשנית למדידת צמיחת עצבים

בעצבים סיאטיים, ניתן למדוד התחדשות אקסונלית¹. בנוסף, מחקרי מבחנה הראו את ההיתכנות של ניטור צמיחה אקסונלית ^2,3 כדי להבין את השלבים השונים שלה, מהנבטה אקסונלית לניוון אקסונלי, הן בנוירונים בריאים והן בתאי עצב פגועים. על ידי מעקב אחר תהליכים אלה, ניתן למדוד פרמטרים כגון קוטביות אקסונלית, חניכה, יציבות והסתעפות. הפרמטר האחרון הוא קריטי להבנת תפיסת כאב נוירופתית ^4,5,6. באופן דומה, ניוון אקסונלי יכול להיות מנוטר in vivo⁷ או in vitro ^8,9. במהלך צמיחת נוירוטים, רשתות שלד אקטין ומיקרוטובול מתייצבות או משתנות בהתאם לצרכי התא¹⁰. שלד האקטין מתארגן מחדש כדי לאפשר את היווצרות חרוט הצמיחה האקסונלי, והמיקרוטובולים מתיישרים מחדש לצרורות כדי לייצב את הנוירוט הגדל¹¹. על מנת לחקור צמיחה של נוירונים מרכזיים והיקפיים במבחנה, מכמתים שלושה פרמטרים נפוצים: אורך אקסונלי כולל, מרחק מקסימלי ונקודות הסתעפות. פרמטרים אלה משמשים לחקר תגובת הצמיחה העצבית לטיפול (כלומר, נוירוטרופינים, תרכובות, מעכבים, חומצה רטינואית, siRNA, shRNA) או בבעלי חיים מהונדסים גנטית 12,13,14. כדי להעריך אם לתאי עצב יש יותר תאי עצב מוארכים ו/או יותר הסתעפות, שלושת הפרמטרים האלה מאפשרים לנו להעריך את המורפולוגיה של תא עצב. מדידת אורך נוריט היא הפרמטר בעל העניין העליון במספר מערכי ניסוי במבחנה. מגרעיני שורש גביים מבוצעים בעיקר שני סוגים של תרבויות: תרבית חוץ גופית מנותקת או תרבות אורגנוטיפית של צמחי DRG שלמים. בכל מקרה, אורך הנוירוט הוא פרמטר זהב להערכת תוצאות הניסוי. בקו תאים דמוי נוירון מוטורי (NSC-34), צמיחה אקסונלית והסתעפות נמדדות לאחר התמיינות המושרה על ידי חומצה רטינואית^15,16. למעשה, על ידי מדידת צמיחת הנוירוטים, ניתן לקבוע אם טיפול מסוים עבד¹⁷, קצב הצמיחה¹⁸, או יכולת ההתחדשות לאחר הליך פציעה¹⁹.

כיצד להעריך נכונה את צמיחת הנוירוטים הציבה מספר לא מבוטל של אתגרים לאורך השנים בתחום המחקר. עם זאת, אין סטנדרטיזציה של מדידות אורך עצבים. חלק מהשיטות הנפוצות ביותר עבור תרביות תאים במבחנה הן, למשל, התוסף הידני NeuronJ בפיג’י^18,20 או MetaMorph^21,23 והנוירולוסידה^{החצי-אוטומטי 23,24}. מלבד מתודולוגיות ידניות, ישנן גם שיטות אוטומטיות, כגון תוסף NeuriteTracer בפיג’י²⁵, תוכנת HCA Vision^26,27 או WIS-NeuroMath ^2,28. מתודולוגיות אחרות פחות מדויקות מסתמכות על מדידת הממד הכולל של הנוירונים. שיטות אלה כוללות מדידת המרחק הווקטורי מגוף התא לקצה האקסון^{הארוך ביותר 29} או ניתוח שול³⁰. עם זאת, שיטות מדידה אלה מתאימות לתרביות בצפיפות נמוכה מאוד או לתאי עצב בודדים. יתר על כן, כל המתודולוגיות הללו משמשות בעיקר על נוירונים מוכתמים או נוירונים המבטאים פלואורופורים מקודדים גנטית (כלומר, GFP, נוגה, mCherry). סוג תא העצב וצפיפות תרבית התא משפיעים עמוקות על בחירת מתודולוגיית המדידה. לדוגמה, פילוח ידני של תאי עצב עם מורפולוגיות מורכבות ומסובכות מאוד, כגון נוירוני DRG, יכול בקלות להפוך למשימה בלתי אפשרית. אם נוירונים מפותלים הם כבר אתגר לסגמנט, רשתות עצביות הן לגמרי מחוץ להישג ידן של גישות ידניות בשל הארגון המורכב מאוד שלהן.

מצד אחד, פילוח ידני מדויק מאוד משום שהוא מבוצע על ידי עיניים אנושיות ואינטליגנציה; מצד שני, זה באמת גוזל זמן. הוצאת הזמן הגבוהה הנדרשת בשיטות ידניות היא החיסרון העיקרי. מסיבה זו, רק נוירונים מעטים נרכשים לניתוח, מה שהופך אותו לפחות מדויק ויקר במונחים של זמן. גישות אוטומטיות או חצי אוטומטיות, לעומת זאת, מצמצמות חלקית את בזבוז הזמן. עם זאת, יש להם גם כמה חסרונות. צריך לאמן שיטות אוטומטיות כדי לעבוד כמו שצריך, ואם התוכנה לא מספיק אינטראקטיבית עם המשתמש, הפילוח יכול להיות שגוי.

מלבד מדידת צמיחת נוירוטים, מספר נקודות ההסתעפות הוא גם מידע בעל ערך. באמצעות פילוח ידני ניתן לחשב את מספר נקודות ההסתעפות, בעוד שהדבר אינו אפשרי עם מרחק וקטורי. בשיטות אוטומטיות, מספר נקודות ההסתעפות מסופק בדרך כלל, ואילו בניתוח שול, יש לחשב אותו באמצעות נוסחה מתמטית.

במאמר שיטות זה, אנו שואפים לתאר את הפונקציונליות והיעילות של תוכנה חצי-אוטומטית זו במדידת האורך האקסונלי הכולל ופרמטרים אחרים. המכונה מאפשרת רכישה אוטומטית של תמונות בנקודות זמן מוגדרות או לביצוע מחקרים ארוכי טווח (ימים, שבועות, חודשים), תוך שמירה על סביבה פיזיולוגית לתאים חיים. למדידת צמיחת תאי עצב באמצעות הדמיית קיטוע זמן של ניגודיות פאזה יש את היתרון בכך שהיא מאפשרת ניטור רציף של קינטיקה וגדילה של נוירוטים. בנוסף, ניתן גם לעקוב אחר מוות תאי באמצעות תוספת במדיה של צבעים ספציפיים המכוונים לתאים מתים 31,32,33. למרות שהתוכנה שוחררה בשנת 2012, אנו הראשונים לתקנן מתודולוגיה זו באופן ניתן לשחזור וללא משוא פנים לכימות מדויק של צמיחת נוירוטים. עם זאת, חשוב לציין כי התוכנה אינה כלולה ברכישת המכונה. למרות הוצאה נוספת זו, השימוש בו מציע יתרונות משמעותיים במדידת אורך אקסונלי כולל ופרמטרים אחרים, ובכך תורם למחקר בתחום מדעי המוח.