Standaardisatie van een nieuwe semi-automatische software voor het meten van de uitgroei van je nauriet
Summary
Neriet-uitgroeianalyses bieden een kwantitatieve waarde over regeneratieve neuronale processen. Het voordeel van deze semi-automatische software is dat het cellichamen en neurieten afzonderlijk segmenteert door een masker te maken en verschillende parameters meet, zoals neurietlengte, aantal vertakkingspunten, cel-lichaamclusteroppervlak en aantal celclusters.
Abstract
Effectieve live-beeldvormingstechnieken zijn cruciaal om de neuronale morfologie te beoordelen om de uitgroei van neurieten in realtime te meten. De juiste meting van de uitgroei van neurieten is in de loop der jaren een langdurige uitdaging geweest op het gebied van neurowetenschappelijk onderzoek. Deze parameter dient als hoeksteen in tal van in vitro experimentele opstellingen, variërend van gedissocieerde culturen en organotypische culturen tot cellijnen. Door de neurietlengte te kwantificeren, is het mogelijk om te bepalen of een specifieke behandeling werkte of dat axonale regeneratie in verschillende experimentele groepen wordt versterkt. In deze studie is het doel om de robuustheid en nauwkeurigheid van de Incucyte Neurotrack neurietuitgroeianalysesoftware aan te tonen. Deze semi-automatische software is beschikbaar in een time-lapse microscopiesysteem dat verschillende voordelen biedt ten opzichte van veelgebruikte methodologieën bij het kwantificeren van de neurietlengte in fasecontrastbeelden. Het algoritme maskeert en kwantificeert verschillende parameters in elke afbeelding en retourneert neuronale celstatistieken, waaronder neurietlengte, vertakkingspunten, cel-lichaamclusters en cel-lichaamclustergebieden. Ten eerste hebben we de robuustheid en nauwkeurigheid van de software gevalideerd door de waarden te correleren met die van de handmatige NeuronJ, een Fiji-plug-in. Ten tweede hebben we het algoritme gebruikt dat zowel op fasecontrastbeelden als op immunocytochemische beelden kan werken. Met behulp van specifieke neuronale markers valideerden we de haalbaarheid van de op fluorescentie gebaseerde analyse van neurietuitgroei op sensorische neuronen in vitroculturen . Bovendien kan deze software de lengte van neurieten meten in verschillende zaaiomstandigheden, variërend van individuele cellen tot complexe neuronale netwerken. Kortom, de software biedt een innovatief en tijdbesparend platform voor neurietuitgroeianalyses, wat de weg vrijmaakt voor snellere en betrouwbaardere kwantificeringen.
Introduction
Bij heupzenuwen is het mogelijk om axonale regeneratie te meten1. Bovendien hebben in vitro studies de haalbaarheid aangetoond van het monitoren van axonale uitgroei 2,3 om de verschillende fasen te begrijpen, van axonale ontkieming tot axonale degeneratie, in zowel gezonde als beschadigde neuronen. Door deze processen te volgen, is het mogelijk om parameters zoals axonale polariteit, initiatie, stabiliteit en vertakking te meten. De laatste parameter is cruciaal om neuropathische pijnperceptiete begrijpen 4,5,6. Evenzo kan axonale degeneratie in vivo7 of in vitro 8,9 worden gecontroleerd. Tijdens de uitgroei van neurieten stabiliseren of veranderen de cytoskeletnetwerken van actine en microtubuli afhankelijk van de behoeften van de cel10. Het actine-cytoskelet reorganiseert zich om de vorming van de axonale groeikegel mogelijk te maken, en de microtubuli worden opnieuw uitgelijnd in bundels om de groeiende neuriet te stabiliseren11. Om de uitgroei van neurieten van centrale en perifere neuronen in vitro te bestuderen, worden drie gemeenschappelijke parameters gekwantificeerd: totale axonale lengte, maximale afstand en vertakkingspunten. Deze parameters worden gebruikt om de neuronale uitgroeirespons op behandeling (d.w.z. neurotrofines, verbindingen, remmers, retinoïnezuur, siRNA, shRNA) of bij genetisch gemodificeerde dieren te bestuderen 12,13,14. Om te beoordelen of neuronen meer langwerpige neurieten en/of meer vertakkingen hebben, stellen deze drie parameters ons in staat om de morfologie van een neuron te beoordelen. De meting van de nierietlengte is de belangrijkste parameter in verschillende in vitro experimentele opstellingen. Vanuit dorsale wortelganglia worden voornamelijk twee soorten culturen uitgevoerd: gedissocieerde in vitro cultuur of organotypische cultuur van hele DRG-explantaten. In beide gevallen is de lengte van neuriet een gouden parameter om de uitkomst van het experiment te beoordelen. In een motorneuronachtige cellijn (NSC-34) worden axonale uitgroei en vertakking gemeten na differentiatie geïnduceerd door retinoïnezuur15,16. Door de uitgroei van neurieten te meten, is het zelfs mogelijk om te bepalen of een specifieke behandeling heeft gewerkt17, de groeisnelheid18 of het regeneratievermogen na een verwondingsprocedure19.
Het goed beoordelen van de uitgroei van neurieten heeft in de loop der jaren een aanzienlijk aantal uitdagingen met zich meegebracht op het gebied van onderzoek. Er is echter geen standaardisatie van neurietlengtemetingen. Enkele van de meest gebruikte methoden voor in vitro celculturen zijn bijvoorbeeld de handmatige NeuronJ-plug-in op Fiji18,20 of MetaMorph21,23 en de semi-automatische Neurolucida23,24. Naast handmatige methodologieën zijn er ook automatische methoden, zoals de NeuriteTracer-plug-in op Fiji25, HCA Vision-software 26,27 of WIS-NeuroMath 2,28. Andere, minder nauwkeurige methodologieën zijn gebaseerd op het meten van de totale dimensie van de neuronen. Deze methoden omvatten de meting van de vectorafstand van het cellichaam tot de punt van het langste axon29 of de Sholl-analyse30. Deze meetmethoden zijn echter geschikt voor culturen met een zeer lage dichtheid of enkele neuronen. Bovendien worden al deze methodologieën voornamelijk gebruikt op gekleurde neuronen of neuronen die genetisch gecodeerde fluoroforen tot expressie brengen (d.w.z. GFP, Venus, mCherry). Het type neuron en de dichtheid van de celcultuur zijn van grote invloed op de keuze van de meetmethode. Het handmatig segmenteren van neuronen met zeer ingewikkelde en gecompliceerde morfologieën, zoals DRG-neuronen, kan bijvoorbeeld gemakkelijk een onmogelijke taak worden. Als ingewikkelde neuronen al een uitdaging zijn om te segmenteren, zijn neurale netwerken volledig onbereikbaar voor handmatige benaderingen vanwege hun zeer complexe organisatie.
Aan de ene kant is handmatige segmentatie zeer nauwkeurig omdat het wordt uitgevoerd door menselijke ogen en intelligentie; Aan de andere kant is het erg tijdrovend. Het grootste nadeel is de verhoogde tijdsbesteding die handmatige methoden vereisen. Om deze reden worden slechts een paar neuronen verworven voor analyse, waardoor het minder nauwkeurig en kostbaar is in termen van tijd. Automatische of semi-automatische benaderingen daarentegen verminderen de tijdsbesteding gedeeltelijk. Ze hebben echter ook enkele nadelen. Automatische methoden moeten worden getraind om goed te werken, en als de software niet interactief genoeg is met de gebruiker, kan de segmentatie verkeerd zijn.
Naast het meten van de uitgroei van neurieten, is ook het aantal vertakkingspunten waardevolle informatie. Met handmatige segmentatie kan het aantal vertakkingspunten worden berekend, terwijl dit met een vectorafstand niet mogelijk is. Bij automatische methoden wordt meestal het aantal vertakkingspunten opgegeven, terwijl bij de Sholl-analyse het met een wiskundige formule moet worden berekend.
In dit methodedocument willen we de functionaliteit en effectiviteit van deze semi-automatische software beschrijven bij het meten van de totale axonale lengte en andere parameters. De machine maakt het mogelijk om automatisch beelden te verkrijgen op gedefinieerde tijdstippen of om langetermijnstudies (dagen, weken, maanden) uit te voeren, waarbij een fysiologische omgeving voor levende cellen behouden blijft. Het meten van de uitgroei van neurieten met behulp van time-lapse-beeldvorming met fasecontrast heeft het voordeel dat de kinetiek en groei van neurieten continu kunnen worden bewaakt. Daarnaast is het ook mogelijk om de celdood te monitoren door de toevoeging in de media van specifieke kleurstoffen die zich richten op dode cellen 31,32,33. Hoewel de software in 2012 is uitgebracht, zijn we de eersten die deze methodologie op een reproduceerbare en onbevooroordeelde manier hebben gestandaardiseerd voor de nauwkeurige kwantificering van de uitgroei van neurieten. Het is echter belangrijk op te merken dat de software niet is inbegrepen bij de aankoop van de machine. Ondanks deze extra kosten biedt het gebruik ervan aanzienlijke voordelen bij het meten van de totale axonale lengte en andere parameters, waardoor het bijdraagt aan onderzoek op het gebied van neurowetenschappen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het nauwkeurig meten van hoe neuronen groeien in gezonde, gewonde en zieke omstandigheden is een cruciale parameter in veel experimentele opstellingen binnen het neurowetenschappelijke veld. Of het nu gaat om het werken met organotypische culturen van hele DRG-explantaten of gedissocieerde culturen, het goed meten van axonale uitgroei is de afgelopen 20 jaar een grote uitdaging geweest. Zonder betrouwbare en nauwkeurige kwantificering van de uitgroei van neurieten is het onmogelijk om te…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We willen Alessandro Vercelli bedanken voor de kritische opmerkingen en de technische ondersteuning van Sartorius voor de hulp. Ons onderzoek naar deze onderwerpen is genereus ondersteund door de Rita-Levi Montalcini Grant 2021 (MIUR, Italië). Dit onderzoek werd gefinancierd door het Ministero dell’Istruzione dell’Università e della Ricerca MIUR-project Dipartimenti di Eccellenza 2023-2027 aan de afdeling Neurowetenschappen Rita Levi Montalcini. Het onderzoek van D.M.R. is uitgevoerd tijdens en met de steun van de Italiaanse nationale interuniversitaire PhD-cursus in Duurzame Ontwikkeling en Klimaatverandering (link: www.phd-sdc.it).
Materials
| Collagenase A | Merck / Roche | 10103586001 | |
| Dispase II (neutral protease, grade II) | Merck / Roche | 4942078001 | |
| Dulbecco's modified eagle's medium | Merck / Sigma | D5796 | |
| Fetal bovin serum | Merck / Sigma | F7524 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix (1X) | ThermoFisher Scientific | 21765029 | |
| Ham's F12 w/ L-Glutamine | Euroclone | ECM0135L | |
| Hanks' Balanced Salt Solution | Euroclone | ECM0507L | |
| HBSS (10X), no calcium, no magnesium, no phenol red | ThermoFisher Scientific | 14185045 | |
| HyClone Characterized Fetal Bovine Serum (U.S.) | Cytiva | SH30071.03 | |
| Incucyte, Neurotrack Analysis Software | Sartorius | 9600-0010 | |
| L-15 Medium (Leibovitz) | Millipore/Sigma | L5520 | |
| Laminin Mouse Protein, Natural | ThermoFisher Scientific | 23017015 | |
| L-Cysteine | Merck / Sigma | C7352 | |
| Leibovitz's L-15 medium w/o L-glutamine | Euroclone | ECB0020L | |
| mouse NGF 2.5S (>95%) | Alomone Labs | N-100 | |
| Neurobasal Medium [-] Glutamine | ThermoFisher Scientific | 21103049 | |
| NSC-34 | CELLutions Biosystems Inc (Ontario, Canada) | CLU140 | |
| Papain from papaya latex | Sigma | P4762 | |
| Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15070063 | |
| Percoll (Density 1.130 g/mL) | Cytiva | 17089101 | |
| Poly-D-Lysine Solution (1mg/mL) | EMD Millipore/Merck | A-003-E | |
| Poly-L-Lysine Solution (0-01%) | Sigma | P4832 | |
| Recombinant Human NT-3 | PeproTech | 450-03 | |
| Retinoic Acid | Merck / Sigma | R2625 | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma | T3924 | |
| β-Tubulin III (Tuj1) antibody | Merck / Sigma | T8660 |
References
- Terenzio, M., et al. Locally translated mTOR controls axonal local translation in nerve injury. Science. 359, 1416-1421 (2018).
- Marvaldi, L., et al. Enhanced axon outgrowth and improved long-distance axon regeneration in sprouty2 deficient mice. Dev Neurobiol. 75, 217-231 (2015).
- Kalinski, A. L., et al. Deacetylation of Miro1 by HDAC6 blocks mitochondrial transport and mediates axon growth inhibition. J Cell Biol. 218, 1871-1890 (2019).
- Marvaldi, L., et al. Importin α3 regulates chronic pain pathways in peripheral sensory neurons. Science. 369, 842-846 (2020).
- Gangadharan, V., et al. Neuropathic pain caused by miswiring and abnormal end organ targeting. Nature. 606, 137-145 (2022).
- Testa, L., Dotta, S., Vercelli, A., Marvaldi, L., et al. Communicating pain: emerging axonal signaling in peripheral neuropathic pain. Front Neuroanat. 18, (2024).
- Thongrong, S., et al. Sprouty2 and -4 hypomorphism promotes neuronal survival and astrocytosis in a mouse model of kainic acid induced neuronal damage. Hippocampus. 26, 658-667 (2016).
- Yaron, A., Schuldiner, O. Common and divergent mechanisms in developmental neuronal remodeling and dying back neurodegeneration. Curr Biol. 26, R628-R639 (2016).
- Maor-Nof, M., et al. Axonal degeneration is regulated by a transcriptional program that coordinates expression of pro- and anti-degenerative factors. Neuron. 92, 991-1006 (2016).
- Bromberg, K. D. Regulation of neurite outgrowth by Gi/o signaling pathways. Front Biosci. 13, 4544-4557 (2008).
- Girouard, M. P., et al. Collapsin response mediator protein 4 (CRMP4) facilitates wallerian degeneration and axon regeneration following Sciatic nerve injury. eNeuro. 7, 0479-0419 (2020).
- van Erp, S., et al. Age-related loss of axonal regeneration is reflected by the level of local translation. Exp Neurol. 339, 113594 (2021).
- Wang, X., et al. Driving axon regeneration by orchestrating neuronal and non-neuronal innate immune responses via the IFNγ-cGAS-STING axis. Neuron. 111, 236-255.e7 (2023).
- Kaselis, A., Treinys, R., Vosyliūtė, R., Šatkauskas, S. DRG axon elongation and growth cone collapse rate induced by Sema3A are differently dependent on NGF concentration. Cell Mol Neurobiol. 34, 289-296 (2014).
- Maier, O., et al. Differentiated NSC-34 motoneuron-like cells as experimental model for cholinergic neurodegeneration. Neurochem Int. 62, 1029-1038 (2013).
- Nango, H., et al. Highly efficient conversion of motor neuron-like NSC-34 cells into functional motor neurons by Prostaglandin E2. Cells. 9, 1741 (2020).
- Kim, H. W., Caspar, T., Shah, S. B., Hsieh, A. H. Effects of proinflammatory cytokines on axonal outgrowth from adult rat lumbar dorsal root ganglia using a novel three-dimensional culture system. Spine J. 15, 1823-1831 (2015).
- Frey, E., et al. An in vitro assay to study induction of the regenerative state in sensory neurons. Exp Neurol. 263, 350-363 (2015).
- Zhang, Z., et al. Cerebellar injury and impaired function in a rabbit model of maternal inflammation induced neonatal brain injury. Neurobiol Learn Mem. 165, 106901 (2019).
- Pemberton, K., Mersman, B., Xu, F. Using ImageJ to assess neurite outgrowth in mammalian cell cultures: Research data quantification exercises in undergraduate neuroscience lab. J Undergrad Neurosci Educ. 16, A186-A194 (2018).
- Marvaldi, L., Hausott, B., Auer, M., Leban, J., Klimaschewski, L. A Novel DRAK inhibitor, SC82510, promotes axon branching of adult sensory neurons in vitro. Neurochem Res. 39, 403-407 (2014).
- Quarta, S., et al. Peripheral nerve regeneration and NGF-dependent neurite outgrowth of adult sensory neurons converge on STAT3 phosphorylation downstream of neuropoietic cytokine receptor gp130. J Neurosci. 34, 13222-13233 (2014).
- Woitke, F., et al. Adult hippocampal neurogenesis poststroke: More new granule cells but aberrant morphology and impaired spatial memory. PLoS One. 12, e0183463 (2017).
- Xiao, X., et al. Automated dendritic spine detection using convolutional neural networks on maximum intensity projected microscopic volumes. J Neurosci Meth. 309, 25-34 (2018).
- Pool, M., Thiemann, J., Bar-Or, A., Fournier, A. E. NeuriteTracer: A novel ImageJ plugin for automated quantification of neurite outgrowth. J Neurosci Meth. 168, 134-139 (2008).
- Wang, D., et al. HCA-Vision: Automated neurite outgrowth analysis. SLAS Disc. 15, 1165-1170 (2010).
- Whitlon, D. S., et al. Novel high content screen detects compounds that promote neurite regeneration from cochlear spiral ganglion neurons. Sci Rep. 5, 15960 (2015).
- Rishal, I., et al. WIS-neuromath enables versatile high throughput analyses of neuronal processes. Dev Neurobiol. 73, 247-256 (2013).
- Smith, D. S., Pate Skene, J. H. A Transcription-dependent switch controls competence of adult neurons for distinct modes of axon growth. J Neurosci. 17, 646-658 (1997).
- Gardiner, N. J., et al. Preconditioning injury-induced neurite outgrowth of adult rat sensory neurons on fibronectin is mediated by mobilisation of axonal α5 integrin. Mol Cell Neurosci. 35, 249-260 (2007).
- Hauck, J. S., et al. Heat shock factor 1 directly regulates transsulfuration pathway to promote prostate cancer proliferation and survival. Commun Biol. 7, 9 (2024).
- Zhu, Y., et al. Loss of WIPI4 in neurodegeneration causes autophagy-independent ferroptosis. Nat Cell Biol. 26, 542-551 (2024).
- Reggiani, F., et al. BET inhibitors drive Natural Killer activation in non-small cell lung cancer via BRD4 and SMAD3. Nat Commun. 15, 2567 (2024).
- Ackerman, H. D., Gerhard, G. S. Bile acids induce neurite outgrowth in NSC-34 cells via TGR5 and a distinct transcriptional profile. Pharmaceuticals. 16, 174 (2023).
- Tuttle, R., Matthew, W. D. Neurotrophins affect the pattern of DRG neurite growth in a bioassay that presents a choice of CNS and PNS substrates. Development. 121, 1301-1309 (1995).
- Wurster, S., et al. Live monitoring and analysis of fungal growth, viability, and mycelial morphology using the IncuCyte NeuroTrack processing module. mBio. 10 (3), e00673-e00619 (2019).
.