توحيد برنامج شبه أوتوماتيكي جديد لقياس نمو الخلايا العصبية
Summary
توفر مقايسات نمو الخلايا العصبية قيمة كمية حول العمليات العصبية المتجددة. تتمثل ميزة هذا البرنامج شبه التلقائي في أنه يقسم أجسام الخلايا والخلايا العصبية بشكل منفصل عن طريق إنشاء قناع ويقيس معلمات مختلفة مثل طول الخلايا العصبية وعدد نقاط الفروع ومنطقة كتلة جسم الخلية وعدد مجموعات الخلايا.
Abstract
تعد تقنيات التصوير الحي الفعالة ضرورية لتقييم مورفولوجيا الخلايا العصبية من أجل قياس نمو الخلايا العصبية في الوقت الفعلي. كان القياس الصحيح لنمو الخلايا العصبية تحديا طويل الأمد على مر السنين في مجال أبحاث علم الأعصاب. تعمل هذه المعلمة كحجر زاوية في العديد من الإعدادات التجريبية في المختبر ، بدءا من الثقافات المنفصلة والثقافات العضوية إلى خطوط الخلايا. من خلال تحديد طول الخلايا العصبية ، من الممكن تحديد ما إذا كان علاج معين يعمل أو إذا تم تعزيز تجديد محور عصبي في مجموعات تجريبية مختلفة. في هذه الدراسة ، الهدف هو إثبات متانة ودقة برنامج تحليل نمو الخلايا العصبية Incucyte Neurotrack. يتوفر هذا البرنامج شبه التلقائي في نظام الفحص المجهري بفاصل زمني والذي يوفر العديد من المزايا مقارنة بالمنهجيات شائعة الاستخدام في القياس الكمي لطول الخلايا العصبية في صور تباين الطور. تقوم الخوارزمية بإخفاء وقياس العديد من المعلمات في كل صورة وإرجاع مقاييس الخلايا العصبية ، بما في ذلك طول الخلايا العصبية ونقاط الفروع ومجموعات جسم الخلية ومناطق كتلة جسم الخلية. أولا ، تحققنا من متانة ودقة البرنامج من خلال ربط قيمه بقيم NeuronJ اليدوية ، وهو مكون إضافي في فيجي. ثانيا ، استخدمنا الخوارزمية القادرة على العمل على كل من صور تباين الطور وكذلك على صور الكيمياء المناعية. باستخدام علامات عصبية محددة ، تحققنا من جدوى تحليل نمو الخلايا العصبية القائم على التألق على الخلايا العصبية الحسية في الثقافات المختبرية . بالإضافة إلى ذلك ، يمكن لهذا البرنامج قياس طول الخلايا العصبية عبر ظروف البذر المختلفة ، بدءا من الخلايا الفردية إلى الشبكات العصبية المعقدة. في الختام ، يوفر البرنامج منصة مبتكرة وفعالة من حيث الوقت لمقايسات نمو الخلايا العصبية ، مما يمهد الطريق لتقديرات كمية أسرع وأكثر موثوقية.
Introduction
في الأعصاب الوركية ، من الممكن قياس التجديد المحوري1. بالإضافة إلى ذلك ، أظهرت الدراسات في المختبر جدوى مراقبة النمو المحوري 2,3 لفهم مراحله المختلفة ، من تنبت المحور العصبي إلى التنكس المحوري ، في كل من الخلايا العصبية السليمة والمصابة. من خلال تتبع هذه العمليات ، من الممكن قياس معلمات مثل القطبية المحورية ، والبدء ، والاستقرار ، والتفرع. المعلمة الأخيرة حاسمة لفهم إدراك ألم الأعصاب4،5،6. وبالمثل ، يمكن مراقبة التنكس المحوري في الجسم الحي7 أو في المختبر 8,9. أثناء نمو الخلايا العصبية ، تستقر شبكات الأكتين والأنابيب الهيكلية الخلوية أو تتغير وفقا لاحتياجات الخلية10. يعاد تنظيم الهيكل الخلوي للأكتين للسماح بتكوين مخروط النمو المحوري ، وتعيد الأنابيب الدقيقة محاذاة في حزم لتثبيت الخلايا العصبيةالمتنامية 11. من أجل دراسة النمو العصبي للخلايا العصبية المركزية والمحيطية في المختبر ، يتم تحديد ثلاث معلمات شائعة: الطول المحوري الكلي ، والمسافة القصوى ، ونقاط الفرع. تستخدم هذه المعلمات لدراسة استجابة النمو العصبي للعلاج (أي التغذية العصبية ، المركبات ، المثبطات ، حمض الريتينويك ، siRNA ، shRNA) أو في المعدلة وراثيا12،13،14. من أجل تقييم ما إذا كانت الخلايا العصبية تحتوي على خلايا عصبية أكثر استطالة و / أو المزيد من التفرع ، تسمح لنا هذه المعلمات الثلاثة بتقييم مورفولوجيا الخلية العصبية. قياس طول Neurite هو المعلمة ذات الاهتمام الأعلى في العديد من الإعدادات التجريبية في المختبر. من العقد الجذرية الظهرية ، يتم إجراء نوعين أساسيين من الثقافات: منفصلة في الثقافة المختبرية أو الثقافة العضوية لنباتات DRG بأكملها. في كلتا الحالتين ، طول الخلايا العصبية هو معلمة ذهبية لتقييم نتيجة التجربة. في خط الخلية الشبيهة بالخلايا العصبية الحركية (NSC-34) ، يتم قياس النمو المحوري والتفرع بعد التمايز الناجم عن حمض الريتينويك 15,16. في الواقع ، من خلال قياس نمو الخلايا العصبية ، من الممكن تحديد ما إذا كان علاج معين قد نجح17 ، أو معدل النمو18 ، أو قدرة التجديد بعد إجراءالإصابة 19.
شكلت كيفية تقييم نمو الخلايا العصبية بشكل صحيح عددا كبيرا من التحديات على مر السنين في مجال البحث. ومع ذلك ، لا يوجد توحيد لقياسات طول الخلايا العصبية. بعض الطرق الأكثر استخداما لمزارع الخلايا في المختبر هي ، على سبيل المثال ، المكون الإضافي اليدوي NeuronJ على فيجي18,20 أو MetaMorph21,23 وشبه التلقائي Neurolucida23,24. بخلاف المنهجيات اليدوية ، هناك طرق تلقائية أيضا ، مثل المكون الإضافي NeuriteTracer على Fiji25 أو برنامج HCA Vision26,27 أو WIS-NeuroMath 2,28. تعتمد منهجيات أخرى أقل دقة على قياس البعد الكلي للخلايا العصبية. تتضمن هذه الطرق قياس المسافة المتجهة من جسم الخلية إلى قمة أطول محورعصبي 29 أو تحليل شول30. ومع ذلك ، فإن طرق القياس هذه مناسبة للثقافات منخفضة الكثافة أو الخلايا العصبية المفردة. علاوة على ذلك ، يتم استخدام كل هذه المنهجيات بشكل أساسي على الخلايا العصبية الملطخة أو الخلايا العصبية التي تعبر عن الفلوروفورات المشفرة وراثيا (مثل GFP و Venus و mCherry). يؤثر نوع الخلايا العصبية وكثافة ثقافة الخلية بعمق على اختيار منهجية القياس. على سبيل المثال ، يمكن أن يصبح تقسيم الخلايا العصبية يدويا بأشكال معقدة ومعقدة للغاية ، مثل الخلايا العصبية DRG ، مهمة مستحيلة بسهولة. إذا كانت الخلايا العصبية المعقدة تمثل بالفعل تحديا للتجزئة ، فإن الشبكات العصبية بعيدة تماما عن متناول الأساليب اليدوية بسبب تنظيمها المعقد للغاية.
من ناحية ، التجزئة اليدوية دقيقة للغاية لأنها تتم بواسطة العين البشرية والذكاء. من ناحية أخرى ، إنها تستغرق وقتا طويلا حقا. الإنفاق الزمني المرتفع الذي تتطلبه الطرق اليدوية هو العيب الرئيسي. لهذا السبب ، يتم الحصول على عدد قليل فقط من الخلايا العصبية للتحليل ، مما يجعلها أقل دقة وتكلفة من حيث الوقت. من ناحية أخرى ، تقلل الأساليب التلقائية أو شبه التلقائية جزئيا من نفقات الوقت. ومع ذلك ، لديهم أيضا بعض العيوب. يجب تدريب الطرق التلقائية من أجل العمل بشكل صحيح ، وإذا لم يكن البرنامج تفاعليا بدرجة كافية مع المستخدم ، فقد يكون التقسيم خاطئا.
بخلاف قياس نمو الخلايا العصبية ، فإن عدد نقاط الفرع هو أيضا معلومات قيمة. باستخدام التجزئة اليدوية ، يمكن حساب عدد نقاط الفرع ، في حين أن هذا غير ممكن مع مسافة متجهة. باستخدام الطرق التلقائية ، عادة ما يتم توفير عدد نقاط الفرع ، بينما مع تحليل Sholl ، يجب حسابه باستخدام صيغة رياضية.
في ورقة الطرق هذه ، نهدف إلى وصف وظائف وفعالية هذا البرنامج شبه التلقائي في قياس الطول المحوري الكلي والمعلمات الأخرى. تسمح الآلة بالحصول التلقائي على الصور في نقاط زمنية محددة أو لإجراء دراسات طويلة الأجل (أيام ، أسابيع ، شهور) ، مع الحفاظ على بيئة فسيولوجية للخلايا الحية. إن قياس نمو الخلايا العصبية باستخدام تصوير الفاصل الزمني لتباين الطور له فائدة في تمكين المراقبة المستمرة لحركية الخلايا العصبية ونموها. بالإضافة إلى ذلك ، من الممكن أيضا مراقبة موت الخلايا من خلال إضافة أصباغ معينة في الوسائط تستهدف الخلايا الميتة31،32،33. على الرغم من إصدار البرنامج في عام 2012 ، إلا أننا أول من قام بتوحيد هذه المنهجية بطريقة قابلة للتكرار وغير متحيزة من أجل التحديد الكمي الدقيق لنمو الخلايا العصبية. ومع ذلك ، من المهم ملاحظة أن البرنامج غير مضمن في شراء الجهاز. على الرغم من هذه النفقات الإضافية ، فإن استخدامه يوفر مزايا كبيرة في قياس الطول المحوري الكلي والمعلمات الأخرى ، وبالتالي المساهمة في البحث في مجال علم الأعصاب.
Protocol
Representative Results
Discussion
يعد القياس الدقيق لكيفية نمو الخلايا العصبية في الظروف الصحية والمصابة والمريضة معلمة حاسمة في العديد من الإعدادات التجريبية في مجال علم الأعصاب. سواء كان العمل مع الثقافات العضوية لنباتات DRG الكاملة أو الثقافات المنفصلة ، فإن قياس النمو المحوري بشكل صحيح كان تحديا كبي…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر أليساندرو فرشيلي على التعليقات النقدية ودعم سارتوريوس الفني للمساعدة. تم دعم بحثنا حول هذه الموضوعات بسخاء من قبل منحة ريتا ليفي مونتالتشيني 2021 (MIUR ، إيطاليا). تم تمويل هذا البحث من قبل وزارة السياحة في جامعة وجامعة ريسيركا MIUR مشروع Dipartimenti di Eccellenza 2023-2027 إلى قسم علم الأعصاب ريتا ليفي مونتالتشيني. تم إجراء بحث DMR أثناء وبدعم من دورة الدكتوراه الوطنية الإيطالية المشتركة بين الجامعات في التنمية المستدامة وتغير المناخ (رابط: www.phd-sdc.it).
Materials
| Collagenase A | Merck / Roche | 10103586001 | |
| Dispase II (neutral protease, grade II) | Merck / Roche | 4942078001 | |
| Dulbecco's modified eagle's medium | Merck / Sigma | D5796 | |
| Fetal bovin serum | Merck / Sigma | F7524 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix (1X) | ThermoFisher Scientific | 21765029 | |
| Ham's F12 w/ L-Glutamine | Euroclone | ECM0135L | |
| Hanks' Balanced Salt Solution | Euroclone | ECM0507L | |
| HBSS (10X), no calcium, no magnesium, no phenol red | ThermoFisher Scientific | 14185045 | |
| HyClone Characterized Fetal Bovine Serum (U.S.) | Cytiva | SH30071.03 | |
| Incucyte, Neurotrack Analysis Software | Sartorius | 9600-0010 | |
| L-15 Medium (Leibovitz) | Millipore/Sigma | L5520 | |
| Laminin Mouse Protein, Natural | ThermoFisher Scientific | 23017015 | |
| L-Cysteine | Merck / Sigma | C7352 | |
| Leibovitz's L-15 medium w/o L-glutamine | Euroclone | ECB0020L | |
| mouse NGF 2.5S (>95%) | Alomone Labs | N-100 | |
| Neurobasal Medium [-] Glutamine | ThermoFisher Scientific | 21103049 | |
| NSC-34 | CELLutions Biosystems Inc (Ontario, Canada) | CLU140 | |
| Papain from papaya latex | Sigma | P4762 | |
| Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15070063 | |
| Percoll (Density 1.130 g/mL) | Cytiva | 17089101 | |
| Poly-D-Lysine Solution (1mg/mL) | EMD Millipore/Merck | A-003-E | |
| Poly-L-Lysine Solution (0-01%) | Sigma | P4832 | |
| Recombinant Human NT-3 | PeproTech | 450-03 | |
| Retinoic Acid | Merck / Sigma | R2625 | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma | T3924 | |
| β-Tubulin III (Tuj1) antibody | Merck / Sigma | T8660 |
References
- Terenzio, M., et al. Locally translated mTOR controls axonal local translation in nerve injury. Science. 359, 1416-1421 (2018).
- Marvaldi, L., et al. Enhanced axon outgrowth and improved long-distance axon regeneration in sprouty2 deficient mice. Dev Neurobiol. 75, 217-231 (2015).
- Kalinski, A. L., et al. Deacetylation of Miro1 by HDAC6 blocks mitochondrial transport and mediates axon growth inhibition. J Cell Biol. 218, 1871-1890 (2019).
- Marvaldi, L., et al. Importin α3 regulates chronic pain pathways in peripheral sensory neurons. Science. 369, 842-846 (2020).
- Gangadharan, V., et al. Neuropathic pain caused by miswiring and abnormal end organ targeting. Nature. 606, 137-145 (2022).
- Testa, L., Dotta, S., Vercelli, A., Marvaldi, L., et al. Communicating pain: emerging axonal signaling in peripheral neuropathic pain. Front Neuroanat. 18, (2024).
- Thongrong, S., et al. Sprouty2 and -4 hypomorphism promotes neuronal survival and astrocytosis in a mouse model of kainic acid induced neuronal damage. Hippocampus. 26, 658-667 (2016).
- Yaron, A., Schuldiner, O. Common and divergent mechanisms in developmental neuronal remodeling and dying back neurodegeneration. Curr Biol. 26, R628-R639 (2016).
- Maor-Nof, M., et al. Axonal degeneration is regulated by a transcriptional program that coordinates expression of pro- and anti-degenerative factors. Neuron. 92, 991-1006 (2016).
- Bromberg, K. D. Regulation of neurite outgrowth by Gi/o signaling pathways. Front Biosci. 13, 4544-4557 (2008).
- Girouard, M. P., et al. Collapsin response mediator protein 4 (CRMP4) facilitates wallerian degeneration and axon regeneration following Sciatic nerve injury. eNeuro. 7, 0479-0419 (2020).
- van Erp, S., et al. Age-related loss of axonal regeneration is reflected by the level of local translation. Exp Neurol. 339, 113594 (2021).
- Wang, X., et al. Driving axon regeneration by orchestrating neuronal and non-neuronal innate immune responses via the IFNγ-cGAS-STING axis. Neuron. 111, 236-255.e7 (2023).
- Kaselis, A., Treinys, R., Vosyliūtė, R., Šatkauskas, S. DRG axon elongation and growth cone collapse rate induced by Sema3A are differently dependent on NGF concentration. Cell Mol Neurobiol. 34, 289-296 (2014).
- Maier, O., et al. Differentiated NSC-34 motoneuron-like cells as experimental model for cholinergic neurodegeneration. Neurochem Int. 62, 1029-1038 (2013).
- Nango, H., et al. Highly efficient conversion of motor neuron-like NSC-34 cells into functional motor neurons by Prostaglandin E2. Cells. 9, 1741 (2020).
- Kim, H. W., Caspar, T., Shah, S. B., Hsieh, A. H. Effects of proinflammatory cytokines on axonal outgrowth from adult rat lumbar dorsal root ganglia using a novel three-dimensional culture system. Spine J. 15, 1823-1831 (2015).
- Frey, E., et al. An in vitro assay to study induction of the regenerative state in sensory neurons. Exp Neurol. 263, 350-363 (2015).
- Zhang, Z., et al. Cerebellar injury and impaired function in a rabbit model of maternal inflammation induced neonatal brain injury. Neurobiol Learn Mem. 165, 106901 (2019).
- Pemberton, K., Mersman, B., Xu, F. Using ImageJ to assess neurite outgrowth in mammalian cell cultures: Research data quantification exercises in undergraduate neuroscience lab. J Undergrad Neurosci Educ. 16, A186-A194 (2018).
- Marvaldi, L., Hausott, B., Auer, M., Leban, J., Klimaschewski, L. A Novel DRAK inhibitor, SC82510, promotes axon branching of adult sensory neurons in vitro. Neurochem Res. 39, 403-407 (2014).
- Quarta, S., et al. Peripheral nerve regeneration and NGF-dependent neurite outgrowth of adult sensory neurons converge on STAT3 phosphorylation downstream of neuropoietic cytokine receptor gp130. J Neurosci. 34, 13222-13233 (2014).
- Woitke, F., et al. Adult hippocampal neurogenesis poststroke: More new granule cells but aberrant morphology and impaired spatial memory. PLoS One. 12, e0183463 (2017).
- Xiao, X., et al. Automated dendritic spine detection using convolutional neural networks on maximum intensity projected microscopic volumes. J Neurosci Meth. 309, 25-34 (2018).
- Pool, M., Thiemann, J., Bar-Or, A., Fournier, A. E. NeuriteTracer: A novel ImageJ plugin for automated quantification of neurite outgrowth. J Neurosci Meth. 168, 134-139 (2008).
- Wang, D., et al. HCA-Vision: Automated neurite outgrowth analysis. SLAS Disc. 15, 1165-1170 (2010).
- Whitlon, D. S., et al. Novel high content screen detects compounds that promote neurite regeneration from cochlear spiral ganglion neurons. Sci Rep. 5, 15960 (2015).
- Rishal, I., et al. WIS-neuromath enables versatile high throughput analyses of neuronal processes. Dev Neurobiol. 73, 247-256 (2013).
- Smith, D. S., Pate Skene, J. H. A Transcription-dependent switch controls competence of adult neurons for distinct modes of axon growth. J Neurosci. 17, 646-658 (1997).
- Gardiner, N. J., et al. Preconditioning injury-induced neurite outgrowth of adult rat sensory neurons on fibronectin is mediated by mobilisation of axonal α5 integrin. Mol Cell Neurosci. 35, 249-260 (2007).
- Hauck, J. S., et al. Heat shock factor 1 directly regulates transsulfuration pathway to promote prostate cancer proliferation and survival. Commun Biol. 7, 9 (2024).
- Zhu, Y., et al. Loss of WIPI4 in neurodegeneration causes autophagy-independent ferroptosis. Nat Cell Biol. 26, 542-551 (2024).
- Reggiani, F., et al. BET inhibitors drive Natural Killer activation in non-small cell lung cancer via BRD4 and SMAD3. Nat Commun. 15, 2567 (2024).
- Ackerman, H. D., Gerhard, G. S. Bile acids induce neurite outgrowth in NSC-34 cells via TGR5 and a distinct transcriptional profile. Pharmaceuticals. 16, 174 (2023).
- Tuttle, R., Matthew, W. D. Neurotrophins affect the pattern of DRG neurite growth in a bioassay that presents a choice of CNS and PNS substrates. Development. 121, 1301-1309 (1995).
- Wurster, S., et al. Live monitoring and analysis of fungal growth, viability, and mycelial morphology using the IncuCyte NeuroTrack processing module. mBio. 10 (3), e00673-e00619 (2019).
.