神経突起伸長測定のための新しい半自動ソフトウェアの標準化

坐骨神経では、軸索再生¹を測定することが可能です。さらに、in vitro研究は、健康なニューロンと損傷したニューロンの両方において、軸索発芽から軸索変性までのさまざまな段階を理解するために、軸索伸長^2,3を監視することの実現可能性を示しています。これらのプロセスを追跡することにより、軸索の極性、開始、安定性、分岐などのパラメータを測定することができます。最後のパラメータは、神経障害性疼痛の知覚を理解するために重要です^4,5,6。同様に、軸索変性はin vivo⁷ またはin vitro ^8,9で監視できます。神経突起伸長中、アクチンおよび微小管の細胞骨格ネットワークは、細胞¹⁰の必要性に応じて安定化または変化する。アクチン細胞骨格は、軸索成長円錐の形成を可能にするために再編成され、微小管は、成長する神経突起を安定させるために束に再整列する¹¹。in vitroで中枢ニューロンと末梢ニューロンの神経突起伸長を研究するために、3つの一般的なパラメータ(総軸索長、最大距離、分岐点)が定量化されます。これらのパラメータは、治療(すなわち、ニューロトロフィン、化合物、阻害剤、レチノイン酸、siRNA、shRNA)または遺伝子組み換え動物12,13,14に対するニューロン伸長反応を研究するために使用される。ニューロンがより細長い神経突起および/またはより多くの分岐を持っているかどうかを評価するために、これらの3つのパラメータにより、ニューロンの形態を評価できます。神経突起長の測定は、いくつかのin vitro実験セットアップで最も重要なパラメータです。後根神経節からは、主に2種類の培養が行われます:解離したin vitro培養または全DRG外植片の器官型培養。いずれの場合も、神経突起の長さは実験の結果を評価するためのゴールドパラメータです。運動ニューロン様細胞株(NSC-34)では、レチノイン酸^15,16による分化後に軸索伸長と分枝が測定されます。実際、神経突起伸長を測定することにより、特定の治療が効いたかどうか¹⁷、成長速度¹⁸、または傷害処置¹⁹後の再生能力を決定することが可能である。

神経突起の成長を適切に評価する方法は、研究分野で長年にわたって多くの課題を提起してきました。ただし、神経突起の長さの測定には標準化されていません。in vitro細胞培養に最も利用されている方法には、例えば、Fiji^18,20またはMetaMorph^21,23の手動NeuronJプラグイン、および半自動のNeurolucida^23,24があります。手動の方法以外にも、Fiji²⁵のNeuriteTracerプラグイン、HCA Visionソフトウェア^26,27、WIS-NeuroMath ^2,28などの自動的な方法もあります。他の精度の低い方法論は、ニューロンの全体的な寸法の測定に依存しています。これらの方法には、細胞体から最も長い軸索²⁹の先端までのベクトル距離の測定、またはショール解析³⁰が含まれる。ただし、これらの測定方法は、非常に低密度の培養物や単一のニューロンに適しています。さらに、これらの方法論はすべて、主に染色されたニューロンまたは遺伝的にコードされた蛍光色素(GFP、Venus、mCherryなど)を発現するニューロンに利用されます。ニューロンの種類と細胞培養の密度は、測定方法の選択に深く影響します。たとえば、DRGニューロンなど、非常に複雑で複雑な形態を持つニューロンを手動でセグメント化することは、簡単に不可能な作業になる可能性があります。畳み込みニューロンがすでにセグメンテーションが課題となっている場合、ニューラルネットは非常に複雑な組織であるため、手動のアプローチでは完全に手の届かないものです。

一方では、手動セグメンテーションは人間の目と知性によって実行されるため、非常に正確です。一方で、それは本当に時間がかかります。手動の方法による時間の浪費が主な欠点です。このため、解析のために取得されるニューロンはごくわずかであり、精度が低く、時間的にコストがかかります。一方、自動または半自動のアプローチは、時間の消費を部分的に削減します。ただし、いくつかの欠点もあります。自動的な手法を適切に機能させるには、トレーニングが必要であり、ソフトウェアがユーザーと十分に対話できなければ、セグメンテーションが間違っている可能性があります。

神経突起伸長の測定以外にも、分岐点の数も貴重な情報です。手動セグメンテーションでは、分岐点の数を計算できますが、ベクトル距離では計算できません。自動的な方法では、通常、分岐点の数が提供されますが、ショール分析では、数式で計算する必要があります。

このメソッドペーパーでは、軸索の全長とその他のパラメーターを測定する際のこの半自動ソフトウェアの機能と有効性を説明することを目的としています。この機械は、定義された時点での画像の自動取得や、生細胞の生理学的環境を維持しながら、長期研究(数日、数週間、数ヶ月)の実施を可能にします。位相コントラストタイムラプスイメージングを使用して神経突起の成長を測定すると、神経突起の動態と成長を継続的に監視できるという利点があります。さらに、死細胞31,32,33を標的とする特異的な色素を培地に添加することにより、細胞死をモニターすることも可能である。このソフトウェアは2012年にリリースされましたが、神経突起伸長の正確な定量化のために、再現性のある偏りのない方法でこの方法論を標準化した最初のソフトウェアです。ただし、ソフトウェアはマシンの購入に含まれていないことに注意することが重要です。この追加費用にもかかわらず、その使用は、総軸索長およびその他のパラメータを測定する上で大きな利点を提供し、それによって神経科学の分野の研究に貢献します。