Standardizzazione di un nuovo software semiautomatico per la misurazione della crescita dei neuriti

Nei nervi sciatici è possibile misurare la rigenerazione assonale¹. Inoltre, studi in vitro hanno dimostrato la fattibilità del monitoraggio della crescita assonale ^2,3 per comprenderne le varie fasi, dalla germinazione assonale alla degenerazione assonale, sia nei neuroni sani che in quelli danneggiati. Tracciando questi processi, è possibile misurare parametri come la polarità assonale, l’iniziazione, la stabilità e la ramificazione. L’ultimo parametro è cruciale per comprendere la percezione del dolore neuropatico ^4,5,6. Allo stesso modo, la degenerazione assonale può essere monitorata in vivo⁷ o in vitro ^8,9. Durante la crescita dei neuriti, le reti citoscheletriche di actina e microtubuli si stabilizzano o cambiano in base alle esigenze della cellula¹⁰. Il citoscheletro di actina si riorganizza per consentire la formazione del cono di crescita assonale e i microtubuli si riallineano in fasci per stabilizzare il neurite¹¹ in crescita. Al fine di studiare la crescita neuritica dei neuroni centrali e periferici in vitro, vengono quantificati tre parametri comuni: lunghezza assonale totale, distanza massima e punti di ramificazione. Questi parametri sono utilizzati per studiare la risposta neuronale di crescita al trattamento (ad esempio, neurotrofine, composti, inibitori, acido retinoico, siRNA, shRNA) o in animali geneticamente modificati 12,13,14. Per valutare se i neuroni hanno neuriti più allungati e/o più ramificati, questi tre parametri ci permettono di valutare la morfologia di un neurone. La misurazione della lunghezza dei neuriti è il parametro di maggiore interesse in diverse configurazioni sperimentali in vitro. Dai gangli delle radici dorsali vengono eseguiti principalmente due tipi di colture: coltura dissociata in vitro o coltura organotipica di espianti interi di DRG. In entrambi i casi, la lunghezza del neurite è un parametro d’oro per valutare l’esito dell’esperimento. In una linea cellulare simile a motoneuroni (NSC-34), la crescita assonale e la ramificazione sono misurate dopo la differenziazione indotta dall’acido retinoico^15,16. Infatti, misurando la crescita dei neuriti, è possibile determinare se un trattamento specifico ha funzionato¹⁷, il tasso di crescita¹⁸ o la capacità di rigenerazione dopo una procedura di lesione¹⁹.

Come valutare correttamente la crescita dei neuriti ha posto un numero significativo di sfide nel corso degli anni nel campo della ricerca. Tuttavia, non esiste una standardizzazione delle misurazioni della lunghezza dei neuriti. Alcuni dei metodi più utilizzati per le colture cellulari in vitro sono, ad esempio, il plug-in manuale NeuronJ su Fiji^18,20 o MetaMorph^21,23 e il semi-automatico Neurolucida^23,24. Oltre alle metodologie manuali, esistono anche metodi automatici, come il plug-in NeuriteTracer su Fiji²⁵, il software HCA Vision^26,27 o WIS-NeuroMath ^2,28. Altre metodologie meno accurate si basano sulla misurazione della dimensione complessiva dei neuroni. Questi metodi includono la misurazione della distanza del vettore dal corpo cellulare alla punta dell’assone^{più lungo 29} o l’analisi di Sholl³⁰. Tuttavia, questi metodi di misurazione sono adatti per colture a densità molto bassa o singoli neuroni. Inoltre, tutte queste metodologie sono utilizzate principalmente su neuroni colorati o neuroni che esprimono fluorofori geneticamente codificati (es. GFP, Venus, mCherry). Il tipo di neurone e la densità della coltura cellulare influenzano profondamente la scelta della metodologia di misurazione. Ad esempio, segmentare manualmente i neuroni con morfologie molto intricate e complicate, come i neuroni DRG, può facilmente diventare un compito impossibile. Se i neuroni contorti sono già una sfida da segmentare, le reti neurali sono completamente fuori dalla portata degli approcci manuali a causa della loro organizzazione altamente complessa.

Da un lato, la segmentazione manuale è molto precisa perché viene eseguita dall’occhio e dall’intelligenza umana; D’altra parte, è davvero dispendioso in termini di tempo. L’elevato dispendio di tempo richiesto dai metodi manuali è lo svantaggio principale. Per questo motivo, solo pochi neuroni vengono acquisiti per l’analisi, rendendola meno accurata e costosa in termini di tempo. Gli approcci automatici o semiautomatici, invece, riducono parzialmente il dispendio di tempo. Tuttavia, presentano anche alcuni svantaggi. I metodi automatici devono essere addestrati per funzionare correttamente e, se il software non è abbastanza interattivo con l’utente, la segmentazione può essere errata.

Oltre alla misurazione della crescita dei neuriti, anche il numero di punti di ramificazione è un’informazione preziosa. Con la segmentazione manuale, il numero di punti di diramazione può essere calcolato, mentre ciò non è possibile con una distanza vettoriale. Con i metodi automatici, il numero di punti di diramazione viene solitamente fornito, mentre con l’analisi Sholl deve essere calcolato con una formula matematica.

In questo articolo sui metodi, miriamo a descrivere la funzionalità e l’efficacia di questo software semiautomatico nella misurazione della lunghezza assonale totale e di altri parametri. La macchina consente l’acquisizione automatica di immagini in punti temporali definiti o per condurre studi a lungo termine (giorni, settimane, mesi), preservando un ambiente fisiologico per le cellule vive. La misurazione della crescita dei neuriti utilizzando l’imaging time-lapse a contrasto di fase ha il vantaggio di consentire il monitoraggio continuo della cinetica e della crescita dei neuriti. Inoltre, è anche possibile monitorare la morte cellulare attraverso l’aggiunta nei terreni di coloranti specifici che hanno come bersaglio le cellule morte 31,32,33. Sebbene il software sia stato rilasciato nel 2012, siamo i primi a standardizzare questa metodologia in modo riproducibile e imparziale per la quantificazione accurata della crescita dei neuriti. Tuttavia, è importante notare che il software non è incluso con l’acquisto della macchina. Nonostante questa spesa aggiuntiva, il suo utilizzo offre vantaggi significativi nella misurazione della lunghezza assonale totale e di altri parametri, contribuendo così alla ricerca nel campo delle neuroscienze.