Стандартизация нового полуавтоматического программного обеспечения для измерения наростов нейритов

В седалищных нервах можно измерить регенерацию аксонов¹. Кроме того, исследования in vitro показали возможность мониторинга вырастания аксонов ^2,3 для понимания его различных фаз, от прорастания аксонов до аксональной дегенерации, как в здоровых, так и в поврежденных нейронах. Отслеживая эти процессы, можно измерить такие параметры, как аксональная полярность, инициация, стабильность и ветвление. Последний параметр имеет решающее значение для понимания нейропатического восприятия боли ^4,5,6. Аналогичным образом, аксональная дегенерация может контролироваться in vivo⁷ или in vitro ^8,9. Во время роста нейритов актин и цитоскелетные сети микротрубочек стабилизируются или изменяются в соответствии с потребностями^{клетки.} Актиновый цитоскелет реорганизуется, что позволяет формировать конус роста аксона, а микротрубочки перестраиваются в пучки для стабилизации растущего нейрита¹¹. Для изучения нейритного роста центральных и периферических нейронов in vitro количественно определены три общих параметра: общая длина аксона, максимальное расстояние и точки ветвления. Эти параметры используются для изучения реакции нейронов на лечение (т.е. нейротрофины, соединения, ингибиторы, ретиноевая кислота, миРНК, шРНК) или у генетически модифицированных животных 12,13,14. Чтобы оценить, имеют ли нейроны более удлиненные нейриты и/или большее разветвление, эти три параметра позволяют нам оценить морфологию нейрона. Измерение длины нейрита является наиболее важным параметром в нескольких экспериментальных установках in vitro. Из ганглиев дорсальных корней выполняют в основном два типа культур: диссоциированную культуру in vitro или органотипическую культуру целых эксплантов DRG. В любом случае, длина нейрита является золотым параметром для оценки результата эксперимента. В линии моторных нейроноподобных клеток (NSC-34) вырастание и ветвление аксонов измеряются после дифференцировки, индуцированной ретиноевой кислотой^15,16. Фактически, измеряя вырост нейритов, можно определить, сработало ли конкретное лечение¹⁷, скорость роста¹⁸ или способность к регенерации после процедуры травмы¹⁹.

Вопрос о том, как правильно оценить рост нейритов, на протяжении многих лет представлял собой значительное количество проблем в области исследований. Тем не менее, стандартизация измерений длины нейритов не существует. Одними из наиболее часто используемых методов для культивирования клеток in vitro являются, например, ручной плагин NeuronJ на Fiji^18,20 или MetaMorph^21,23 и полуавтоматический Neurolucida^23,24. Помимо ручных методологий, существуют и автоматические методы, такие как плагин NeuriteTracer на Fiji²⁵, программное обеспечение HCA Vision^26,27 или WIS-NeuroMath ^2,28. Другие, менее точные методологии основаны на измерении общего размера нейронов. Эти методы включают измерение векторного расстояния от тела клетки до кончика самого длинного аксона²⁹ или анализ^{Шолля 30}. Тем не менее, эти методы измерения подходят для культур с очень низкой плотностью или отдельных нейронов. Более того, все эти методологии в основном используются на окрашенных нейронах или нейронах, экспрессирующих генетически кодируемые флуорофоры (например, GFP, Venus, mCherry). Тип нейрона и плотность клеточной культуры сильно влияют на выбор методики измерения. Например, ручная сегментация нейронов с очень запутанной и сложной морфологией, таких как нейроны DRG, может легко стать невыполнимой задачей. Если извилистые нейроны уже представляют собой проблему для сегментации, то нейронные сети полностью недосягаемы для ручных подходов из-за их очень сложной организации.

С одной стороны, ручная сегментация очень точна, потому что она выполняется человеческими глазами и интеллектом; С другой стороны, это действительно отнимает много времени. Основным недостатком являются повышенные временные затраты, требуемые ручными методами. По этой причине для анализа приобретается всего несколько нейронов, что делает его менее точным и дорогостоящим с точки зрения времени. Автоматические или полуавтоматические подходы, с другой стороны, частично сокращают временные затраты. Однако у них есть и некоторые недостатки. Автоматические методы необходимо обучить, чтобы они работали должным образом, и если программное обеспечение недостаточно интерактивно с пользователем, сегментация может быть ошибочной.

Помимо измерения роста нейритов, количество точек ветвления также является ценной информацией. При ручной сегментации можно рассчитать количество точек ответвления, в то время как с векторным расстоянием это невозможно. При автоматических методах обычно указывается количество точек ветвления, тогда как при анализе Шолля его приходится вычислять по математической формуле.

В данной статье мы стремимся описать функциональность и эффективность этого полуавтоматического программного обеспечения при измерении общей длины аксонов и других параметров. Аппарат позволяет автоматически получать изображения в определенные моменты времени или проводить долгосрочные исследования (дни, недели, месяцы), сохраняя физиологическую среду для живых клеток. Измерение роста нейритов с помощью фазово-контрастной покадровой визуализации позволяет осуществлять непрерывный мониторинг кинетики и роста нейритов. Кроме того, можно также контролировать гибель клеток путем добавления в среду специфических красителей, нацеленных на мертвые клетки 31,32,33. Несмотря на то, что программное обеспечение было выпущено в 2012 году, мы первыми стандартизировали эту методологию воспроизводимым и непредвзятым образом для точной количественной оценки роста нейритов. Однако важно отметить, что программное обеспечение не входит в комплект поставки устройства. Несмотря на эти дополнительные расходы, его использование дает значительные преимущества при измерении общей длины аксонов и других параметров, тем самым способствуя исследованиям в области нейронауки.