Standardisierung einer neuartigen halbautomatischen Software zur Messung des Neuritenwachstums

Bei Ischiasnerven ist es möglich, die axonale Regeneration zu messen¹. Darüber hinaus haben In-vitro-Studien gezeigt, dass es machbar ist, das axonale Wachstum ^2,3 zu überwachen, um seine verschiedenen Phasen, von der axonalen Keimung bis zur axonalen Degeneration, sowohl in gesunden als auch in verletzten Neuronen zu verstehen. Durch die Verfolgung dieser Prozesse ist es möglich, Parameter wie axonale Polarität, Initiierung, Stabilität und Verzweigung zu messen. Der letzte Parameter ist entscheidend für das Verständnis der neuropathischen Schmerzwahrnehmung ^4,5,6. In ähnlicher Weise kann die axonale Degeneration in vivo⁷ oder in vitro ^8,9 überwacht werden. Während des Auswachsens von Neuriten stabilisieren sich Aktin und Mikrotubuli Zytoskelett-Netzwerke oder verändern sich entsprechend den Bedürfnissen der Zelle¹⁰. Das Aktin-Zytoskelett reorganisiert sich, um die Bildung des axonalen Wachstumskegels zu ermöglichen, und die Mikrotubuli richten sich zu Bündeln neu aus, um den wachsenden Neurit^{zu stabilisieren 11}. Um das Wachstum von Neuriten aus zentralen und peripheren Neuronen in vitro zu untersuchen, werden drei gängige Parameter quantifiziert: die Gesamtlänge des Axons, der maximale Abstand und die Verzweigungspunkte. Diese Parameter werden verwendet, um die Reaktion der Neuronen auf die Behandlung (d. h. Neurotrophine, Verbindungen, Inhibitoren, Retinsäure, siRNA, shRNA) oder bei genetisch veränderten Tieren zu untersuchen 12,13,14. Um beurteilen zu können, ob Neuronen länglichere Neuriten und/oder mehr Verzweigungen aufweisen, ermöglichen uns diese drei Parameter, die Morphologie eines Neurons zu beurteilen. Die Messung der Neuritlängen ist der wichtigste Parameter in mehreren in vitro Versuchsaufbauten. Aus Spinalganglien werden hauptsächlich zwei Arten von Kulturen durchgeführt: dissoziierte in vitro-Kulturen oder organotypische Kulturen ganzer DRG-Explantate. In beiden Fällen ist die Neuritenlänge ein Goldparameter, um das Ergebnis des Experiments zu beurteilen. In einer Motoneuron-ähnlichen Zelllinie (NSC-34) werden axonales Wachstum und Verzweigung nach Differenzierung durch Retinsäure gemessen^15,16. Tatsächlich ist es durch die Messung des Neuritenauswuchses möglich zu bestimmen, ob eine bestimmte Behandlung gewirkt hat¹⁷, die Wachstumsrate¹⁸ oder die Regenerationsfähigkeit nach einem Verletzungseingriff¹⁹.

Die richtige Beurteilung des Neuritenwachstums hat im Laufe der Jahre eine Reihe von Herausforderungen im Forschungsbereich mit sich gebracht. Es gibt jedoch keine Standardisierung der Neuritenlängenmessungen. Einige der am häufigsten verwendeten Methoden für in vitro Zellkulturen sind z.B. das manuelle NeuronJ Plug-in auf Fiji^18,20 oder MetaMorph^21,23 und das halbautomatische Neurolucida^23,24. Neben manuellen Methoden gibt es auch automatische Methoden, wie z. B. das NeuriteTracer-Plug-in auf Fiji²⁵, die HCA Vision Software^26,27 oder WIS-NeuroMath ^2,28. Andere, weniger genaue Methoden beruhen auf der Messung der Gesamtdimension der Neuronen. Zu diesen Methoden gehören die Messung des Vektorabstands vom Zellkörper bis zur Spitze des längsten Axons²⁹ oder die Sholl-Analyse³⁰. Diese Messmethoden eignen sich jedoch für Kulturen mit sehr geringer Dichte oder einzelne Neuronen. Darüber hinaus werden alle diese Methoden hauptsächlich bei gefärbten Neuronen oder Neuronen angewendet, die genetisch kodierte Fluorophore exprimieren (z. B. GFP, Venus, mCherry). Die Art des Neurons und die Dichte der Zellkultur haben einen großen Einfluss auf die Wahl der Messmethode. Zum Beispiel kann die manuelle Segmentierung von Neuronen mit sehr komplizierten und komplizierten Morphologien, wie z. B. DRG-Neuronen, leicht zu einer unmöglichen Aufgabe werden. Wenn verschachtelte Neuronen bereits eine Herausforderung bei der Segmentierung darstellen, sind neuronale Netze aufgrund ihrer hochkomplexen Organisation für manuelle Ansätze völlig unerreichbar.

Einerseits ist die manuelle Segmentierung sehr präzise, da sie vom menschlichen Auge und der Intelligenz durchgeführt wird; Auf der anderen Seite ist es wirklich zeitaufwändig. Der erhöhte Zeitaufwand, der durch manuelle Methoden erforderlich ist, ist der größte Nachteil. Aus diesem Grund werden nur wenige Neuronen für die Analyse gewonnen, was sie ungenauer und zeitsparender macht. Automatische oder halbautomatische Ansätze reduzieren hingegen teilweise den Zeitaufwand. Sie haben jedoch auch einige Nachteile. Automatische Methoden müssen trainiert werden, um richtig zu funktionieren, und wenn die Software nicht interaktiv genug mit dem Benutzer ist, kann die Segmentierung falsch sein.

Neben der Messung des Neuritenwachstums ist auch die Anzahl der Verzweigungspunkte eine wertvolle Information. Bei der manuellen Segmentierung kann die Anzahl der Verzweigungspunkte berechnet werden, während dies bei einem Vektorabstand nicht möglich ist. Bei automatischen Verfahren wird in der Regel die Anzahl der Verzweigungspunkte angegeben, während sie bei der Sholl-Analyse mit einer mathematischen Formel berechnet werden muss.

In diesem Methodenpapier wollen wir die Funktionalität und Effektivität dieser halbautomatischen Software bei der Messung der Gesamtaxonlänge und anderer Parameter beschreiben. Das Gerät ermöglicht die automatische Aufnahme von Bildern zu definierten Zeitpunkten oder die Durchführung von Langzeitstudien (Tage, Wochen, Monate), wobei eine physiologische Umgebung für lebende Zellen erhalten bleibt. Die Messung des Neuritenwachstums mittels Phasenkontrast-Zeitraffer-Bildgebung hat den Vorteil, dass sie eine kontinuierliche Überwachung der Neuritenkinetik und des Neuritenwachstums ermöglicht. Darüber hinaus ist es auch möglich, den Zelltod durch Zugabe von spezifischen Farbstoffen in den Medien zu überwachen, die auf tote Zellen abzielen 31,32,33. Obwohl die Software bereits im Jahr 2012 veröffentlicht wurde, sind wir die ersten, die diese Methodik auf reproduzierbare und unvoreingenommene Weise für die genaue Quantifizierung des Neuritenwachstums standardisiert haben. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass die Software nicht beim Kauf der Maschine enthalten ist. Trotz dieses zusätzlichen Aufwands bietet seine Verwendung erhebliche Vorteile bei der Messung der Gesamtaxonlänge und anderer Parameter und trägt damit zur Forschung auf dem Gebiet der Neurowissenschaften bei.