Nörit büyüme ölçümü için yeni bir yarı otomatik yazılımın standardizasyonu
Summary
Nörit büyüme testleri, rejeneratif nöronal süreçler hakkında nicel bir değer sağlar. Bu yarı otomatik yazılımın avantajı, bir maske oluşturarak hücre gövdelerini ve nöritleri ayrı ayrı bölümlere ayırması ve nörit uzunluğu, dal noktası sayısı, hücre-gövde küme alanı ve hücre kümesi sayısı gibi çeşitli parametreleri ölçmesidir.
Abstract
Etkili canlı görüntüleme teknikleri, nörit büyümesini gerçek zamanlı olarak ölçmek için nöronal morfolojiyi değerlendirmek için çok önemlidir. Nörit büyümesinin doğru ölçümü, sinirbilim araştırma alanında yıllar boyunca uzun süredir devam eden bir zorluk olmuştur. Bu parametre, ayrışmış kültürler ve organotipik kültürlerden hücre hatlarına kadar çok sayıda in vitro deney düzeneğinde bir köşe taşı görevi görür. Nörit uzunluğunu ölçerek, farklı deney gruplarında spesifik bir tedavinin işe yarayıp yaramadığını veya aksonal rejenerasyonun geliştirilip geliştirilmediğini belirlemek mümkündür. Bu çalışmada amaç, Incucyte Neurotrack nörit büyüme analiz yazılımının sağlamlığını ve doğruluğunu ortaya koymaktır. Bu yarı otomatik yazılım, faz kontrast görüntülerinde nörit uzunluğunun ölçülmesinde yaygın olarak kullanılan metodolojilere göre çeşitli avantajlar sunan hızlandırılmış bir mikroskopi sisteminde mevcuttur. Algoritma, her görüntüdeki birkaç parametreyi maskeler ve ölçer ve nörit uzunluğu, dal noktaları, hücre-gövde kümeleri ve hücre-gövde küme alanları dahil olmak üzere nöronal hücre ölçümlerini döndürür. İlk olarak, yazılımın sağlamlığını ve doğruluğunu, değerlerini bir Fiji eklentisi olan manuel NeuronJ’ninkilerle ilişkilendirerek doğruladık. İkinci olarak, hem faz kontrast görüntüleri hem de immünositokimya görüntüleri üzerinde çalışabilen algoritmayı kullandık. Spesifik nöronal belirteçler kullanarak, in vitro kültürlerde duyusal nöronlar üzerinde floresan bazlı nörit büyüme analizinin fizibilitesini doğruladık. Ek olarak, bu yazılım, tek tek hücrelerden karmaşık nöronal ağlara kadar çeşitli tohumlama koşullarında nörit uzunluğunu ölçebilir. Sonuç olarak, yazılım, nörit büyüme tahlilleri için yenilikçi ve zaman açısından etkin bir platform sağlayarak daha hızlı ve daha güvenilir miktar tayinlerinin önünü açar.
Introduction
Siyatik sinirlerde aksonal rejenerasyonuölçmek mümkündür 1. Ek olarak, in vitro çalışmalar, hem sağlıklı hem de yaralı nöronlarda aksonal filizlenmeden aksonal dejenerasyona kadar çeşitli aşamalarını anlamak için aksonal büyümenin 2,3 izlenmesinin fizibilitesini göstermiştir. Bu süreçleri takip ederek aksonal polarite, başlatma, kararlılık ve dallanma gibi parametreleri ölçmek mümkündür. Son parametre nöropatik ağrı algısını anlamak için çok önemlidir 4,5,6. Benzer şekilde, aksonal dejenerasyon in vivo7 veya in vitro 8,9 izlenebilir. Nörit büyümesi sırasında, aktin ve mikrotübül hücre iskeleti ağları, hücrenin ihtiyaçlarına göre stabilize olur veya değişir10. Aktin hücre iskeleti, aksonal büyüme konisinin oluşumuna izin vermek için yeniden düzenlenir ve mikrotübüller, büyüyen nörit11’i stabilize etmek için demetler halinde yeniden hizalanır. Merkezi ve periferik nöronların nörit büyümesini in vitro olarak incelemek için üç ortak parametre ölçülür: toplam aksonal uzunluk, maksimum mesafe ve dal noktaları. Bu parametreler, tedaviye (yani nörotrofinler, bileşikler, inhibitörler, retinoik asit, siRNA, shRNA) veya genetiği değiştirilmiş hayvanlardanöronal büyüme yanıtını incelemek için kullanılır 12,13,14. Nöronların daha uzun nöritlere ve/veya daha fazla dallanmaya sahip olup olmadığını değerlendirmek için, bu üç parametre bir nöronun morfolojisini değerlendirmemize izin verir. Nörit uzunluğu ölçümü, çeşitli in vitro deney düzeneklerinde en çok ilgi gören parametredir. Dorsal kök gangliyonlarından esas olarak iki tip kültür gerçekleştirilir: dissosiyasyon in vitro kültür veya tüm DRG eksplantlarının organotipik kültürü. Her iki durumda da, nörit uzunluğu, deneyin sonucunu değerlendirmek için altın bir parametredir. Motor nöron benzeri bir hücre hattında (NSC-34), retinoik asit15,16 tarafından indüklenen farklılaşmadan sonra aksonal büyüme ve dallanma ölçülür. Aslında, nörit büyümesini ölçerek, belirli bir tedavinin işe yarayıp yaramadığını17, büyüme hızının18 veya bir yaralanma prosedüründen sonra rejenerasyon kapasitesinin19 olup olmadığını belirlemek mümkündür.
Nörit büyümesinin doğru bir şekilde nasıl değerlendirileceği, araştırma alanında yıllar boyunca önemli sayıda zorluk ortaya çıkarmıştır. Bununla birlikte, nörit uzunluğu ölçümlerinin standardizasyonu yoktur. İn vitro hücre kültürleri için en çok kullanılan yöntemlerden bazıları, örneğin, Fiji18,20 veya MetaMorph21,23 üzerindeki manuel NeuronJ eklentisi ve yarı otomatik Neurolucida 23,24’tür. Manuel metodolojilerin yanı sıra, Fiji25’teki NeuriteTracer eklentisi, HCA Vision yazılımı 26,27 veya WIS-NeuroMath 2,28 gibi otomatik yöntemler de vardır. Diğer daha az doğru metodolojiler, nöronların genel boyutunun ölçülmesine dayanır. Bu yöntemler, hücre gövdesinden en uzun akson29’un ucuna kadar olan vektör mesafesinin ölçümünü veya Sholl analizini30 içerir. Bununla birlikte, bu ölçüm yöntemleri çok düşük yoğunluklu kültürler veya tek nöronlar için uygundur. Ayrıca, tüm bu metodolojiler esas olarak lekeli nöronlar veya genetik olarak kodlanmış floroforları (yani GFP, Venüs, mCherry) ifade eden nöronlar üzerinde kullanılır. Nöronun tipi ve hücre kültürünün yoğunluğu, ölçüm metodolojisi seçimini derinden etkiler. Örneğin, DRG nöronları gibi çok karmaşık ve karmaşık morfolojilere sahip nöronları manuel olarak segmentlere ayırmak kolayca imkansız bir görev haline gelebilir. Kıvrımlı nöronları segmentlere ayırmak zaten bir zorluksa, sinir ağları son derece karmaşık organizasyonları nedeniyle manuel yaklaşımlar için tamamen erişilemez.
Bir yandan, manuel segmentasyon çok hassastır çünkü insan gözü ve zekası ile gerçekleştirilir; Öte yandan, gerçekten zaman alıcıdır. Manuel yöntemlerin gerektirdiği yüksek zaman harcaması ana dezavantajdır. Bu nedenle, analiz için sadece birkaç nöron elde edilir, bu da onu zaman açısından daha az doğru ve maliyetli hale getirir. Otomatik ya da yarı otomatik yaklaşımlar ise harcanan zamanı kısmen azaltıyor. Bununla birlikte, bazı dezavantajları da vardır. Otomatik yöntemlerin düzgün çalışması için eğitilmesi gerekir ve yazılım kullanıcıyla yeterince etkileşimli değilse, segmentasyon yanlış olabilir.
Nörit büyüme ölçümü dışında, dal noktalarının sayısı da değerli bir bilgidir. Manuel segmentasyon ile dallanma noktalarının sayısı hesaplanabilirken, bu bir vektör mesafesi ile mümkün değildir. Otomatik yöntemlerde genellikle dallanma noktalarının sayısı sağlanırken, Sholl analizinde matematiksel bir formülle hesaplanması gerekir.
Bu yöntem belgesinde, bu yarı otomatik yazılımın toplam aksonal uzunluğu ve diğer parametreleri ölçmedeki işlevselliğini ve etkinliğini açıklamayı amaçlıyoruz. Makine, görüntülerin belirli zaman noktalarında otomatik olarak alınmasına veya canlı hücreler için fizyolojik bir ortamın korunmasına izin vererek uzun vadeli çalışmalar (günler, haftalar, aylar) yapılmasına olanak tanır. Faz kontrastlı hızlandırılmış görüntüleme kullanılarak nörit büyümesinin ölçülmesi, nörit kinetiğinin ve büyümesinin sürekli izlenmesini sağlama avantajına sahiptir. Ek olarak, ölü hücreleri hedef alan spesifik boyaların ortama eklenmesi yoluyla hücre ölümünü izlemek de mümkündür 31,32,33. Yazılım 2012 yılında piyasaya sürülmesine rağmen, nörit büyümesinin doğru bir şekilde ölçülmesi için bu metodolojiyi tekrarlanabilir ve tarafsız bir şekilde standartlaştıran ilk biziz. Ancak, yazılımın makinenin satın alınmasına dahil olmadığını unutmamak önemlidir. Bu ek masrafa rağmen, kullanımı toplam aksonal uzunluk ve diğer parametrelerin ölçülmesinde önemli avantajlar sunmakta ve böylece sinirbilim alanındaki araştırmalara katkıda bulunmaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nöronların sağlıklı, yaralı ve hastalıklı koşullarda nasıl büyüdüğünü doğru bir şekilde ölçmek, sinirbilim alanındaki birçok deney düzeneğinde kritik bir parametredir. İster tüm DRG eksplantlarının organotipik kültürleri ile ister ayrışmış kültürlerle çalışılıyor olsun, aksonal büyümenin doğru bir şekilde ölçülmesi son 20 yılda önemli bir zorluk olmuştur. Nörit büyümesinin güvenilir ve doğru bir şekilde ölçülmesi olmadan, NSC-34…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Eleştirel yorumları için Alessandro Vercelli’ye ve yardım için Sartorius’un teknik desteğine teşekkür etmek istiyoruz. Bu konulardaki araştırmamız Rita-Levi Montalcini Grant 2021 (MIUR, İtalya) tarafından cömertçe desteklenmiştir. Bu araştırma, Ministero dell’Istruzione dell’Università e della Ricerca MIUR projesi Dipartimenti di Eccellenza 2023-2027 tarafından Sinirbilim Bölümü Rita Levi Montalcini’ye finanse edilmiştir. DMR’nin araştırması, Sürdürülebilir Kalkınma ve İklim Değişikliği alanında İtalyan ulusal üniversiteler arası doktora kursu sırasında ve bu kursun desteğiyle yürütülmüştür (bağlantı: www.phd-sdc.it).
Materials
| Collagenase A | Merck / Roche | 10103586001 | |
| Dispase II (neutral protease, grade II) | Merck / Roche | 4942078001 | |
| Dulbecco's modified eagle's medium | Merck / Sigma | D5796 | |
| Fetal bovin serum | Merck / Sigma | F7524 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix (1X) | ThermoFisher Scientific | 21765029 | |
| Ham's F12 w/ L-Glutamine | Euroclone | ECM0135L | |
| Hanks' Balanced Salt Solution | Euroclone | ECM0507L | |
| HBSS (10X), no calcium, no magnesium, no phenol red | ThermoFisher Scientific | 14185045 | |
| HyClone Characterized Fetal Bovine Serum (U.S.) | Cytiva | SH30071.03 | |
| Incucyte, Neurotrack Analysis Software | Sartorius | 9600-0010 | |
| L-15 Medium (Leibovitz) | Millipore/Sigma | L5520 | |
| Laminin Mouse Protein, Natural | ThermoFisher Scientific | 23017015 | |
| L-Cysteine | Merck / Sigma | C7352 | |
| Leibovitz's L-15 medium w/o L-glutamine | Euroclone | ECB0020L | |
| mouse NGF 2.5S (>95%) | Alomone Labs | N-100 | |
| Neurobasal Medium [-] Glutamine | ThermoFisher Scientific | 21103049 | |
| NSC-34 | CELLutions Biosystems Inc (Ontario, Canada) | CLU140 | |
| Papain from papaya latex | Sigma | P4762 | |
| Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15070063 | |
| Percoll (Density 1.130 g/mL) | Cytiva | 17089101 | |
| Poly-D-Lysine Solution (1mg/mL) | EMD Millipore/Merck | A-003-E | |
| Poly-L-Lysine Solution (0-01%) | Sigma | P4832 | |
| Recombinant Human NT-3 | PeproTech | 450-03 | |
| Retinoic Acid | Merck / Sigma | R2625 | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma | T3924 | |
| β-Tubulin III (Tuj1) antibody | Merck / Sigma | T8660 |
References
- Terenzio, M., et al. Locally translated mTOR controls axonal local translation in nerve injury. Science. 359, 1416-1421 (2018).
- Marvaldi, L., et al. Enhanced axon outgrowth and improved long-distance axon regeneration in sprouty2 deficient mice. Dev Neurobiol. 75, 217-231 (2015).
- Kalinski, A. L., et al. Deacetylation of Miro1 by HDAC6 blocks mitochondrial transport and mediates axon growth inhibition. J Cell Biol. 218, 1871-1890 (2019).
- Marvaldi, L., et al. Importin α3 regulates chronic pain pathways in peripheral sensory neurons. Science. 369, 842-846 (2020).
- Gangadharan, V., et al. Neuropathic pain caused by miswiring and abnormal end organ targeting. Nature. 606, 137-145 (2022).
- Testa, L., Dotta, S., Vercelli, A., Marvaldi, L., et al. Communicating pain: emerging axonal signaling in peripheral neuropathic pain. Front Neuroanat. 18, (2024).
- Thongrong, S., et al. Sprouty2 and -4 hypomorphism promotes neuronal survival and astrocytosis in a mouse model of kainic acid induced neuronal damage. Hippocampus. 26, 658-667 (2016).
- Yaron, A., Schuldiner, O. Common and divergent mechanisms in developmental neuronal remodeling and dying back neurodegeneration. Curr Biol. 26, R628-R639 (2016).
- Maor-Nof, M., et al. Axonal degeneration is regulated by a transcriptional program that coordinates expression of pro- and anti-degenerative factors. Neuron. 92, 991-1006 (2016).
- Bromberg, K. D. Regulation of neurite outgrowth by Gi/o signaling pathways. Front Biosci. 13, 4544-4557 (2008).
- Girouard, M. P., et al. Collapsin response mediator protein 4 (CRMP4) facilitates wallerian degeneration and axon regeneration following Sciatic nerve injury. eNeuro. 7, 0479-0419 (2020).
- van Erp, S., et al. Age-related loss of axonal regeneration is reflected by the level of local translation. Exp Neurol. 339, 113594 (2021).
- Wang, X., et al. Driving axon regeneration by orchestrating neuronal and non-neuronal innate immune responses via the IFNγ-cGAS-STING axis. Neuron. 111, 236-255.e7 (2023).
- Kaselis, A., Treinys, R., Vosyliūtė, R., Šatkauskas, S. DRG axon elongation and growth cone collapse rate induced by Sema3A are differently dependent on NGF concentration. Cell Mol Neurobiol. 34, 289-296 (2014).
- Maier, O., et al. Differentiated NSC-34 motoneuron-like cells as experimental model for cholinergic neurodegeneration. Neurochem Int. 62, 1029-1038 (2013).
- Nango, H., et al. Highly efficient conversion of motor neuron-like NSC-34 cells into functional motor neurons by Prostaglandin E2. Cells. 9, 1741 (2020).
- Kim, H. W., Caspar, T., Shah, S. B., Hsieh, A. H. Effects of proinflammatory cytokines on axonal outgrowth from adult rat lumbar dorsal root ganglia using a novel three-dimensional culture system. Spine J. 15, 1823-1831 (2015).
- Frey, E., et al. An in vitro assay to study induction of the regenerative state in sensory neurons. Exp Neurol. 263, 350-363 (2015).
- Zhang, Z., et al. Cerebellar injury and impaired function in a rabbit model of maternal inflammation induced neonatal brain injury. Neurobiol Learn Mem. 165, 106901 (2019).
- Pemberton, K., Mersman, B., Xu, F. Using ImageJ to assess neurite outgrowth in mammalian cell cultures: Research data quantification exercises in undergraduate neuroscience lab. J Undergrad Neurosci Educ. 16, A186-A194 (2018).
- Marvaldi, L., Hausott, B., Auer, M., Leban, J., Klimaschewski, L. A Novel DRAK inhibitor, SC82510, promotes axon branching of adult sensory neurons in vitro. Neurochem Res. 39, 403-407 (2014).
- Quarta, S., et al. Peripheral nerve regeneration and NGF-dependent neurite outgrowth of adult sensory neurons converge on STAT3 phosphorylation downstream of neuropoietic cytokine receptor gp130. J Neurosci. 34, 13222-13233 (2014).
- Woitke, F., et al. Adult hippocampal neurogenesis poststroke: More new granule cells but aberrant morphology and impaired spatial memory. PLoS One. 12, e0183463 (2017).
- Xiao, X., et al. Automated dendritic spine detection using convolutional neural networks on maximum intensity projected microscopic volumes. J Neurosci Meth. 309, 25-34 (2018).
- Pool, M., Thiemann, J., Bar-Or, A., Fournier, A. E. NeuriteTracer: A novel ImageJ plugin for automated quantification of neurite outgrowth. J Neurosci Meth. 168, 134-139 (2008).
- Wang, D., et al. HCA-Vision: Automated neurite outgrowth analysis. SLAS Disc. 15, 1165-1170 (2010).
- Whitlon, D. S., et al. Novel high content screen detects compounds that promote neurite regeneration from cochlear spiral ganglion neurons. Sci Rep. 5, 15960 (2015).
- Rishal, I., et al. WIS-neuromath enables versatile high throughput analyses of neuronal processes. Dev Neurobiol. 73, 247-256 (2013).
- Smith, D. S., Pate Skene, J. H. A Transcription-dependent switch controls competence of adult neurons for distinct modes of axon growth. J Neurosci. 17, 646-658 (1997).
- Gardiner, N. J., et al. Preconditioning injury-induced neurite outgrowth of adult rat sensory neurons on fibronectin is mediated by mobilisation of axonal α5 integrin. Mol Cell Neurosci. 35, 249-260 (2007).
- Hauck, J. S., et al. Heat shock factor 1 directly regulates transsulfuration pathway to promote prostate cancer proliferation and survival. Commun Biol. 7, 9 (2024).
- Zhu, Y., et al. Loss of WIPI4 in neurodegeneration causes autophagy-independent ferroptosis. Nat Cell Biol. 26, 542-551 (2024).
- Reggiani, F., et al. BET inhibitors drive Natural Killer activation in non-small cell lung cancer via BRD4 and SMAD3. Nat Commun. 15, 2567 (2024).
- Ackerman, H. D., Gerhard, G. S. Bile acids induce neurite outgrowth in NSC-34 cells via TGR5 and a distinct transcriptional profile. Pharmaceuticals. 16, 174 (2023).
- Tuttle, R., Matthew, W. D. Neurotrophins affect the pattern of DRG neurite growth in a bioassay that presents a choice of CNS and PNS substrates. Development. 121, 1301-1309 (1995).
- Wurster, S., et al. Live monitoring and analysis of fungal growth, viability, and mycelial morphology using the IncuCyte NeuroTrack processing module. mBio. 10 (3), e00673-e00619 (2019).
.