Standardisation d’un nouveau logiciel semi-automatique pour la mesure de l’excroissance des neurites

Dans les nerfs sciatiques, il est possible de mesurer la régénération axonale¹. De plus, des études in vitro ont montré la faisabilité de la surveillance de la croissance axonale ^2,3 pour comprendre ses différentes phases, de la germination axonale à la dégénérescence axonale, dans les neurones sains et blessés. En suivant ces processus, il est possible de mesurer des paramètres tels que la polarité axonale, l’initiation, la stabilité et la ramification. Le dernier paramètre est crucial pour comprendre la perception de la douleur neuropathique ^4,5,6. De même, la dégénérescence axonale peut être surveillée in vivo⁷ ou in vitro ^8,9. Au cours de la croissance des neurites, les réseaux cytosquelettiques d’actine et de microtubules se stabilisent ou changent en fonction des besoins de la cellule¹⁰. Le cytosquelette d’actine se réorganise pour permettre la formation du cône de croissance axonale, et les microtubules se réalignent en faisceaux pour stabiliser le neurite¹¹ en croissance. Afin d’étudier in vitro la croissance des neurites centrales et périphériques, trois paramètres communs sont quantifiés : la longueur axonale totale, la distance maximale et les points de branche. Ces paramètres sont utilisés pour étudier la réponse de l’excroissance neuronale au traitement (c.-à-d. neurotrophines, composés, inhibiteurs, acide rétinoïque, siRNA, shRNA) ou chez les animaux génétiquement modifiés 12,13,14. Afin d’évaluer si les neurones ont des neurites plus allongés et/ou plus ramifiés, ces trois paramètres nous permettent d’évaluer la morphologie d’un neurone. La mesure de la longueur des neurites est le paramètre d’intérêt majeur dans plusieurs montages expérimentaux in vitro. À partir des ganglions de la racine dorsale, principalement deux types de cultures sont réalisés : la culture in vitro dissociée ou la culture organotypique d’explants entiers de DRG. Dans les deux cas, la longueur des neurites est un paramètre d’or pour évaluer le résultat de l’expérience. Dans une lignée cellulaire de type motoneurone (NSC-34), la croissance axonale et la ramification sont mesurées après différenciation induite par l’acide rétinoïque^15,16. En fait, en mesurant la croissance des neurites, il est possible de déterminer si un traitement spécifique a fonctionné¹⁷, le taux de croissance¹⁸ ou la capacité de régénération après une procédure de blessure¹⁹.

La façon d’évaluer correctement la croissance des neurites a posé un nombre important de défis au fil des ans dans le domaine de la recherche. Cependant, il n’y a pas de normalisation des mesures de longueur des neurites. Certaines des méthodes les plus utilisées pour les cultures cellulaires in vitro sont, par exemple, le plug-in manuel NeuronJ sur Fiji^18,20 ou MetaMorph^21,23 et le semi-automatique Neurolucida^23,24. Outre les méthodologies manuelles, il existe également des méthodes automatiques, telles que le plug-in NeuriteTracer sur Fiji²⁵, le logiciel HCA Vision^26,27 ou WIS-NeuroMath ^2,28. D’autres méthodologies moins précises reposent sur la mesure de la dimension globale des neurones. Ces méthodes comprennent la mesure de la distance du vecteur entre le corps cellulaire et l’extrémité de l’axone le plus long²⁹ ou l’analyse de Sholl³⁰. Cependant, ces méthodes de mesure sont adaptées aux cultures de très faible densité ou aux neurones uniques. De plus, toutes ces méthodologies sont principalement utilisées sur des neurones colorés ou des neurones exprimant des fluorophores génétiquement codés (c’est-à-dire GFP, Venus, mCherry). Le type de neurone et la densité de la culture cellulaire influencent profondément le choix de la méthodologie de mesure. Par exemple, segmenter manuellement des neurones aux morphologies très complexes et compliquées, tels que les neurones DRG, peut facilement devenir une tâche impossible. Si les neurones alambiqués sont déjà un défi à segmenter, les réseaux neuronaux sont complètement hors de portée pour les approches manuelles en raison de leur organisation très complexe.

D’une part, la segmentation manuelle est très précise car elle est effectuée par l’œil humain et l’intelligence ; D’un autre côté, cela prend vraiment du temps. Le temps élevé consacré aux méthodes manuelles est le principal inconvénient. Pour cette raison, seuls quelques neurones sont acquis pour l’analyse, ce qui le rend moins précis et moins coûteux en termes de temps. Les approches automatiques ou semi-automatiques, en revanche, réduisent partiellement la perte de temps. Cependant, ils présentent également quelques inconvénients. Les méthodes automatiques ont besoin d’être entraînées pour fonctionner correctement, et si le logiciel n’est pas assez interactif avec l’utilisateur, la segmentation peut être erronée.

Outre la mesure de l’excroissance des neurites, le nombre de points de branche est également une information précieuse. Avec la segmentation manuelle, le nombre de points de branche peut être calculé, alors que cela n’est pas possible avec une distance vectorielle. Avec les méthodes automatiques, le nombre de points de branche est généralement fourni, tandis qu’avec l’analyse Sholl, il doit être calculé à l’aide d’une formule mathématique.

Dans cet article méthodologique, nous visons à décrire la fonctionnalité et l’efficacité de ce logiciel semi-automatique dans la mesure de la longueur axonale totale et d’autres paramètres. La machine permet l’acquisition automatique d’images à des points temporels définis ou la réalisation d’études à long terme (jours, semaines, mois), en préservant un environnement physiologique pour les cellules vivantes. La mesure de la croissance des neurites à l’aide de l’imagerie time-lapse à contraste de phase présente l’avantage de permettre une surveillance continue de la cinétique et de la croissance des neurites. De plus, il est également possible de surveiller la mort cellulaire par l’ajout dans le milieu de colorants spécifiques qui ciblent les cellules mortes 31,32,33. Bien que le logiciel ait été publié en 2012, nous sommes les premiers à standardiser cette méthodologie de manière reproductible et impartiale pour la quantification précise de la croissance des neurites. Cependant, il est important de noter que le logiciel n’est pas inclus avec l’achat de la machine. Malgré cette dépense supplémentaire, son utilisation offre des avantages significatifs dans la mesure de la longueur axonale totale et d’autres paramètres, contribuant ainsi à la recherche dans le domaine des neurosciences.