Summary

Estandarización de un novedoso software semiautomático para la medición del crecimiento de neuritas

Published: August 09, 2024
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Summary

Los ensayos de excrecencia de neuritas proporcionan un valor cuantitativo sobre los procesos neuronales regenerativos. La ventaja de este software semiautomático es que segmenta los cuerpos celulares y las neuritas por separado mediante la creación de una máscara y mide varios parámetros, como la longitud de las neuritas, el número de puntos de ramificación, el área del grupo de cuerpos celulares y el número de grupos celulares.

Abstract

Las técnicas efectivas de imagen en vivo son cruciales para evaluar la morfología neuronal con el fin de medir el crecimiento de neuritas en tiempo real. La medición adecuada del crecimiento de neuritas ha sido un desafío de larga data a lo largo de los años en el campo de la investigación en neurociencia. Este parámetro sirve como piedra angular en numerosas configuraciones experimentales in vitro , que van desde cultivos disociados y cultivos organotípicos hasta líneas celulares. Al cuantificar la longitud de la neurita, es posible determinar si un tratamiento específico funcionó o si se potencia la regeneración axonal en diferentes grupos experimentales. En este estudio, el objetivo es demostrar la robustez y precisión del software de análisis de crecimiento de neuritas Incucyte Neurotrack. Este software semiautomático está disponible en un sistema de microscopía de lapso de tiempo que ofrece varias ventajas sobre las metodologías comúnmente utilizadas en la cuantificación de la longitud de la neurita en imágenes de contraste de fase. El algoritmo enmascara y cuantifica varios parámetros en cada imagen y devuelve métricas de células neuronales, incluida la longitud de las neuritas, los puntos de ramificación, los grupos de cuerpos celulares y las áreas de grupos de cuerpos celulares. En primer lugar, validamos la robustez y precisión del software correlacionando sus valores con los del manual NeuronJ, un plug-in de Fiji. En segundo lugar, utilizamos el algoritmo que es capaz de trabajar tanto en imágenes de contraste de fase como en imágenes de inmunocitoquímica. Utilizando marcadores neuronales específicos, validamos la viabilidad del análisis de crecimiento de neuritas basado en fluorescencia en neuronas sensoriales en cultivos in vitro . Además, este software puede medir la longitud de las neuritas en diversas condiciones de siembra, que van desde células individuales hasta redes neuronales complejas. En conclusión, el software proporciona una plataforma innovadora y eficaz en el tiempo para los ensayos de crecimiento de neuritas, allanando el camino para cuantificaciones más rápidas y fiables.

Introduction

En los nervios ciáticos, es posible medir la regeneración axonal1. Además, estudios in vitro han demostrado la viabilidad de monitorizar el crecimiento axonal 2,3 para comprender sus diversas fases, desde la brotación axonal hasta la degeneración axonal, tanto en neuronas sanas como lesionadas. Mediante el seguimiento de estos procesos, es posible medir parámetros como la polaridad axonal, la iniciación, la estabilidad y la ramificación. Este último parámetro es crucial para entender la percepción del dolor neuropático 4,5,6. Del mismo modo, la degeneración axonal puede ser monitorizada in vivo7 o in vitro 8,9. Durante el crecimiento de las neuritas, las redes de citoesqueletos de actina y microtúbulos se estabilizan o cambian de acuerdo con las necesidades de la célula10. El citoesqueleto de actina se reorganiza para permitir la formación del cono de crecimiento axonal, y los microtúbulos se realinean en haces para estabilizar la neurita en crecimiento11. Con el fin de estudiar el crecimiento de las neuronas centrales y periféricas in vitro, se cuantifican tres parámetros comunes: longitud axonal total, distancia máxima y puntos de ramificación. Estos parámetros se utilizan para estudiar la respuesta de crecimiento neuronal al tratamiento (i.e., neurotrofinas, compuestos, inhibidores, ácido retinoico, siRNA, shRNA) o en animales modificados genéticamente 12,13,14. Para evaluar si las neuronas tienen neuritas más alargadas y/o más ramificadas, estos tres parámetros permiten evaluar la morfología de una neurona. La medición de la longitud de las neuritas es el parámetro de mayor interés en varios montajes experimentales in vitro. A partir de los ganglios de la raíz dorsal, se realizan principalmente dos tipos de cultivos: cultivo in vitro disociado o cultivo organotípico de explantes enteros de DRG. En cualquier caso, la longitud de la neurita es un parámetro de oro para evaluar el resultado del experimento. En una línea celular similar a una neurona motora (NSC-34), se mide el crecimiento axonal y la ramificación después de la diferenciación inducida por el ácido retinoico15,16. De hecho, al medir el crecimiento de las neuritas, es posible determinar si un tratamiento específico ha funcionado17, la tasa de crecimiento18 o la capacidad de regeneración después de un procedimiento de lesión19.

La forma de evaluar adecuadamente el crecimiento de las neuritas ha planteado un número significativo de desafíos a lo largo de los años en el campo de la investigación. Sin embargo, no existe una estandarización de las mediciones de la longitud de las neuritas. Algunos de los métodos más utilizados para el cultivo celular in vitro son, por ejemplo, el plug-in manual NeuronJ en Fiji18,20 o MetaMorph21,23 y el semiautomático Neurolucida23,24. Además de las metodologías manuales, también existen métodos automáticos, como el plug-in NeuriteTracer en Fiji25, el software HCA Vision26,27 o WIS-NeuroMath 2,28. Otras metodologías menos precisas se basan en la medición de la dimensión general de las neuronas. Estos métodos incluyen la medición de la distancia vectorial desde el cuerpo de la célula hasta la punta del axónmás largo 29 o el análisis de Sholl30. Sin embargo, estos métodos de medición son adecuados para cultivos de muy baja densidad o neuronas individuales. Además, todas estas metodologías se utilizan principalmente en neuronas teñidas o neuronas que expresan fluoróforos codificados genéticamente (es decir, GFP, Venus, mCherry). El tipo de neurona y la densidad del cultivo celular afectan profundamente a la elección de la metodología de medición. Por ejemplo, segmentar manualmente neuronas con morfologías muy intrincadas y complicadas, como las neuronas DRG, puede convertirse fácilmente en una tarea imposible. Si las neuronas enrevesadas ya son un desafío para segmentar, las redes neuronales están completamente fuera del alcance de los enfoques manuales debido a su organización altamente compleja.

Por un lado, la segmentación manual es muy precisa porque la realizan los ojos y la inteligencia humanos; Por otro lado, lleva mucho tiempo. El elevado gasto de tiempo requerido por los métodos manuales es el principal inconveniente. Por esta razón, solo se adquieren unas pocas neuronas para el análisis, lo que lo hace menos preciso y costoso en términos de tiempo. Los enfoques automáticos o semiautomáticos, por otro lado, reducen parcialmente el gasto de tiempo. Sin embargo, también tienen algunas desventajas. Los métodos automáticos necesitan ser entrenados para que funcionen correctamente, y si el software no es lo suficientemente interactivo con el usuario, la segmentación puede ser incorrecta.

Además de la medición del crecimiento de neuritas, el número de puntos de ramificación también es información valiosa. Con la segmentación manual, se puede calcular el número de puntos de bifurcación, mientras que esto no es posible con una distancia vectorial. Con los métodos automáticos, generalmente se proporciona el número de puntos de bifurcación, mientras que con el análisis de Sholl, debe calcularse con una fórmula matemática.

En este artículo de métodos, nuestro objetivo es describir la funcionalidad y efectividad de este software semiautomático en la medición de la longitud axonal total y otros parámetros. La máquina permite la adquisición automática de imágenes en puntos de tiempo definidos o para la realización de estudios a largo plazo (días, semanas, meses), preservando un entorno fisiológico para las células vivas. La medición del crecimiento de las neuritas mediante imágenes de lapso de tiempo de contraste de fase tiene la ventaja de permitir un monitoreo continuo de la cinética y el crecimiento de las neuritas. Además, también es posible monitorear la muerte celular a través de la adición en los medios de colorantes específicos que se dirigen a las células muertas 31,32,33. Aunque el software se lanzó en 2012, somos los primeros en estandarizar esta metodología de forma reproducible e imparcial para la cuantificación precisa del crecimiento de neuritas. Sin embargo, es importante tener en cuenta que el software no está incluido con la compra de la máquina. A pesar de este gasto adicional, su uso ofrece ventajas significativas en la medición de la longitud axonal total y otros parámetros, contribuyendo así a la investigación en el campo de la neurociencia.

Protocol

1. Escaneo del recipiente en la máquina NOTA: La detección se realiza mediante la cámara Basler Ace 1920-155 μm incorporada. Abra el programa haciendo clic en Conectar al dispositivo y seleccionando Programar – Adquirir. A continuación, haga clic en el signo + . Especifique si el buque se escaneará repetidamente o solo 1 vez eligiendo la opción Escanear a tiempo o Escanear una vez ahora, respectivamente. Seleccione Nuevo para crear un recipiente completamente nuevo para escanear. Si no se agrega un nuevo recipiente, cree un nuevo escaneo utilizando una de las opciones que se describen a continuación.Seleccione Copiar actual para crear una nueva embarcación copiando una embarcación de la programación actual. Seleccione Copiar anterior para crear una nueva embarcación copiando una embarcación escaneada anteriormente. Seleccione Agregar escaneo para restaurar un recipiente escaneado previamente para escaneos adicionales. Seleccione el tipo de escaneo en función del ensayo y la aplicación. Para el análisis, seleccione Estándar. Especifique la configuración de análisis. Elija una de las opciones Célula por célula, ya sea Ninguna, Célula adherente por célula o Célula por célula no adherente, y especifique los canales de imagen en función de las moléculas fluorescentes utilizadas. Seleccione la opción Ninguno para cultivos de neuronas sensoriales adultas y embrionarias. En las líneas de celda, seleccione las opciones Ninguno o Célula por celda adherente . Seleccione el objetivo del microscopio (4x, 10x, 20x). Se adquieren con el aumento más alto (20x) en cultivos primarios, mientras que en líneas celulares, 10x es suficiente. Seleccione el tipo de recipiente que desea escanear de las opciones proporcionadas. Indique la ubicación de la embarcación en el cajón seleccionando su posición en el mapa virtual del cajón. Especifique el patrón de escaneo para la adquisición de imágenes seleccionando los pocillos que desea escanear. Seleccione el número deseado de imágenes por pocillo. Aparecerá una estimación de la duración del escaneo. Proporcione información sobre el buque escribiendo el nombre y especifique el mapa de la placa haciendo clic en el signo + . Haga clic en Siguiente. Elija el Tipo de análisis y haga clic en Siguiente. Aparecerá una pantalla de resumen de las opciones seleccionadas. Si es correcto, haga clic en Escanear ahora y se iniciará el escaneo. 2. Configuración para el análisis de imágenes de contraste de fase NOTA: El análisis de Neurotrack solo se puede realizar en imágenes previamente adquiridas por la máquina. Seleccione el recipiente escaneado que desea analizar. Seleccione Iniciar análisis. Seleccione Crear nueva definición de análisis. Selecciona Neurotrack. Seleccione Canales de imagen. Seleccione un conjunto representativo de imágenes para realizar el análisis. Seleccione todas las imágenes de cada pozo para entrenar el algoritmo. Refine la configuración de Definición de análisis ajustando los siguientes parámetros.NOTA: De forma predeterminada, las neuritas están segmentadas en magenta, mientras que los cuerpos celulares en amarillo. Es posible modificar los colores como se desee.Para la segmentación de clústeres de cuerpos de celdas, ajuste lo siguiente como se describe a continuación.Modo de segmentación: La segmentación de las imágenes se realiza para distinguir los cuerpos celulares del fondo y las neuritas. Elige entre Brillo y Textura. Para cultivos primarios y líneas celulares, seleccione el modo de brillo. Ajuste de segmentación: Utilice el control deslizante para ajustar la sensibilidad de segmentación hacia más fondo o más celdas. Oscila entre 0 (Fondo) y 2 (Celdas). Aumenta o disminuye el tamaño de la mascarilla amarilla. Mueva el control deslizante hacia 0 (Fondo) para que el tamaño de la máscara amarilla se reduzca gradualmente, dejando espacio para la máscara magenta. Lo contrario ocurre si el control deslizante se mueve hacia 2 (celdas). Para la limpieza, ajuste lo siguiente como se describe a continuación.Relleno de agujero (μm2): Ajústelo para eliminar cualquier agujero en la máscara del cuerpo de la célula más pequeño que el área especificada por el usuario. Ajustar tamaño (píxeles): Aumente (si es positivo) o reduzca (si es negativo) la máscara amarilla en el número especificado de píxeles. Oscila entre -10 y +10. Ajuste esto para agregar o eliminar la segmentación amarilla en los objetos de alto contraste, como las células muertas y los desechos celulares. Ancho mínimo de la célula (μm): elija un valor para definir el tamaño en el que los cuerpos de las células se considerarán como neuritas. En el caso de los filtros de clúster de cuerpo de celda, ajuste lo siguiente como se describe a continuación.Área (μm2): Establezca un valor mínimo y máximo del área del cuerpo de la célula. Los valores por encima y por debajo de los valores establecidos no se considerarán cuerpos de celda. Para los parámetros de neurita, ajuste lo siguiente como se describe a continuación.Filtrado: Reduce el enmascaramiento de pequeñas imperfecciones y residuos de vasos. Elija entre las opciones Ninguno, Mejor y Mejor. Elija Ninguno solo para cultivos y recipientes muy limpios. Elija Mejor para un procesamiento más rápido a expensas de perder la detección de neuritas muy finas. Puede ser suficiente para células con neuritas gruesas o de alto contraste; Además, puede ser útil para embarcaciones con muchas imperfecciones o desechos. Elija Mejor para un tiempo de procesamiento más prolongado, pero es la configuración de filtro más sensible para garantizar la detección de neuritas muy finas. Sensibilidad de las neuritas: Se utiliza para ajustar la sensibilidad de detección. Aumente la sensibilidad para detectar neuritas más finas. Oscila entre 0,25 (menos) y 0,75 (más).NOTA: Aumenta o disminuye la sensibilidad del software para reconocer neuritas. Si el control deslizante se mueve hacia 0,25 (menos), el software será más estricto en su reconocimiento de neuritas. En cambio, si el control deslizante se mueve hacia 0.75 (Más), el software será menos estricto en esta detección y, por lo tanto, más imperfecciones (es decir, restos de celdas, suciedad) se considerarán neuritas. Ancho de la neurita (μm): Utilícelo para ajustar la detección al tamaño de las neuronas. Puede ser 1, 2 o 4. Al aumentarlo, no se considerarán las neuritas más delgadas. Establézcalo en 1 para cultivos de neuronas sensoriales adultas primarias y 2 para líneas celulares y cultivos de neuronas sensoriales embrionarias. Haga clic en Vista previa actual para visualizar la imagen segmentada. Se proporcionarán las siguientes medidas para cada imagen: Longitud de la neurita (mm/mm2), Puntos de ramificación de la neurita (pormm2), Grupos de cuerpo celular (pormm2) y Área del grupo de cuerpo celular (mm2/mm2). Repita los pasos 2.3 y 2.4 para todas las imágenes seleccionadas. Haga clic en Siguiente. Seleccione el tiempo de escaneo y el pozo para analizar. Asigne un Nombre de Definición y, si es necesario, Notas de Análisis. Haga clic en Siguiente > Finalizar. 3. Configuración para el análisis de imágenes de inmunocitoquímica (ICC) Siga los mismos pasos que se ilustran de la versión 2.1 a la 2.4. Seleccione los canales de imagen para neuritas y núcleos. Seleccione el Conjunto de imágenes; seleccione Todas las imágenes de cada pozo para entrenar el algoritmo. Perfeccione la configuración de Definición de análisis ajustando los siguientes parámetros, tal y como se describe a continuación.NOTA: De forma predeterminada, las neuritas están segmentadas en azul, mientras que los cuerpos celulares son morados. Sin embargo, los colores se pueden modificar como se desee.Segmentación de clústeres de cuerpos celulares: utilícela para segmentar la imagen en objetos de interés. Calcule el brillo del fondo en cada píxel de la imagen. Una vez encontrado el fondo, realice una de las siguientes opciones.Sin sustracción de fondo: Utilícelo para segmentar sin alterar la imagen original. Elija entre Umbral adaptable o Fijo. Adaptativo: el fondo se utiliza para encontrar objetos, pero no se resta explícitamente; con esta opción, es posible establecer el ajuste de umbral (GCU). Umbral fijo: los objetos que son más brillantes que este umbral se detectan en la imagen original; con esta opción, es posible establecer el umbral (GCU). Resta de fondo: usa esta opción para restar el fondo de la imagen mediante una transformación de Top-Hat y, a continuación, aplicarle un umbral. Con esta opción, establezca Radio y Umbral. Radio: se utiliza un disco de este radio; El disco debe ser lo suficientemente grande como para que no quepa completamente dentro de ningún objeto de la imagen. Umbral: los objetos que son más brillantes que este umbral se detectan en la imagen sustraída por el fondo. Limpieza: Utilice la siguiente opción para realizar esto.Relleno de agujeros (μm2): Utilícelo para eliminar los agujeros de la máscara del cuerpo de la célula que sean más pequeños que el área especificada. Ajustar tamaño (píxeles): Utilícelo para aumentar (si es positivo) o reducir (si es negativo) la máscara púrpura en el número especificado de píxeles. El rango es de -10 a +10. Agrega o elimina el púrpura en objetos de alto contraste, como células muertas y desechos celulares. Ancho mínimo de la célula (μm): Utilícelo para definir el tamaño en el que los cuerpos de las células se considerarán como neuritas. Filtros de clúster de cuerpo de celda: utilice la siguiente opción para aplicar los filtros.Área (μm2): Establezca un valor mínimo y máximo del área del cuerpo de la célula. Los valores por encima y por debajo de los valores establecidos no se considerarán cuerpos de celda. Parámetros de Neurite: Utilice la siguiente opción para establecerlos.Sensibilidad gruesa de la neurita: Utilícela para ajustar el brillo de la neurita. La sensibilidad debe aumentarse si la intensidad de fluorescencia de las neuritas es baja. Va de 0 (Menos) a 10 (Más). Aumenta o disminuye la sensibilidad del software para reconocer neuritas menos brillantes. Los valores óptimos oscilan entre 7 y 10; Tenga en cuenta que si se establece en 10, es muy probable que también se considere el fondo en la medición de la neurita. Sensibilidad fina de la neurita: Utilícela para ajustar la sensibilidad de detección. Se debe aumentar la sensibilidad para detectar neuritas más finas. Oscila entre 0,25 (menos) y 0,75 (más). Aumenta o disminuye la sensibilidad del software para reconocer neuritas finas y menos brillantes. Si el control deslizante se mueve hacia 0,25 (menos), el software no tendrá en cuenta las neuritas débiles. En cambio, si el control deslizante se mueve hacia 0.75 (Más), el software detectará también neuritas muy tenues (casi de fondo). Anchura de la neurita (μm): Utilícela para ajustar la detección al tamaño de las neuronas. Puede ser 1, 2 o 4. Al aumentarlo, no se considerarán las neuritas más delgadas. Configúrelo en 1 para cultivos de neuronas sensoriales adultas primarias, en 2 para líneas celulares y cultivos de neuronas sensoriales embrionarias. 4. Exportación de datos Abra el análisis. Haga clic en Métricas gráficas. Seleccione la métrica, los puntos de tiempo y los pozos de interés. Seleccione la opción de agrupación entre Todo, Ninguno, Columnas, Filas y Réplicas de mapa de placas. Haga clic en Exportar datos y seleccione la carpeta de destino y, si es necesario, otras opciones. Se creará un archivo .txt.NOTA: La máquina proporcionará un único valor promedio de la métrica elegida para cada pozo. Se requiere una anotación manual durante el análisis para recuperar valores de imagen individuales. 5. Exportación de imágenes Abra el recipiente. Haga clic en Exportar imágenes y películas. Seleccione el tipo de exportación para las imágenes.Seleccione Como se muestra para exportar las imágenes tal como se muestran. Haga clic en Siguiente y seleccione las imágenes de interés para exportar. Haga clic en Siguiente.Seleccione el Tipo de secuencia entre una sola película o serie de imágenes y los puntos de tiempo de interés. Haga clic en Siguiente. Ajuste las opciones de exportación según sea necesario y haga clic en Siguiente. Establezca la carpeta de salida, el formato de archivo y el nombre del archivo y, a continuación, haga clic en Exportar. Seleccione Como almacenado para exportar imágenes en formato RAW. Seleccione el tipo de imagen.Seleccione los puntos de tiempo y los pozos de interés. Haga clic en Siguiente. Establezca la carpeta de salida, el formato de archivo y el nombre del archivo y, a continuación, haga clic en Exportar. Exportación de imágenes con las máscaras de segmentaciónAbra el análisis. Haga clic en el icono de Capas de imagen. Seleccione las máscaras de canales deseadas (Fase Neurita y Fase Célula de Agrupación de Cuerpos). Siga el paso 5.2.

Representative Results

El algoritmo de medición del crecimiento de neuritas es robustamente capaz de detectar neuritas tanto en redes neuronales como en neuronas individuales. Genera una máscara amarilla que segmenta objetos con alto contraste, como cuerpos celulares, restos celulares, células muertas, explantes de tejido y sombras. Además, aparece una máscara magenta en neuritas de varios grosores. Los valores de longitud de la neurita se proporcionan en mm/mm2, lo que indica que la longitud a…

Discussion

Medir con precisión cómo crecen las neuronas en condiciones sanas, lesionadas y enfermas es un parámetro crítico en muchas configuraciones experimentales dentro del campo de la neurociencia. Ya sea que se trabaje con cultivos organotípicos de explantes enteros de DRG o cultivos disociados, la medición adecuada del crecimiento axonal ha sido un desafío importante en los últimos 20 años. Sin una cuantificación fiable y precisa del crecimiento de neuritas, es imposible evaluar si …

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Queremos agradecer a Alessandro Vercelli por los comentarios críticos y el apoyo técnico de Sartorius por la ayuda. Nuestra investigación sobre estos temas ha sido generosamente apoyada por la Beca Rita-Levi Montalcini 2021 (MIUR, Italia). Esta investigación fue financiada por el Ministero dell’Istruzione dell’Università e della Ricerca MIUR project Dipartimenti di Eccellenza 2023-2027 al Departamento de Neurociencia Rita Levi Montalcini. La investigación de D.M.R. se ha llevado a cabo durante y con el apoyo del curso nacional de doctorado interuniversitario italiano en Desarrollo Sostenible y Cambio Climático (enlace: www.phd-sdc.it).

Materials

Collagenase A Merck / Roche 10103586001
Dispase II (neutral protease, grade II) Merck / Roche 4942078001
Dulbecco's modified eagle's medium Merck / Sigma D5796
Fetal bovin serum  Merck / Sigma F7524
Ham's F-12 Nutrient Mix (1X) ThermoFisher Scientific 21765029
Ham's F12 w/ L-Glutamine Euroclone ECM0135L
Hanks' Balanced Salt Solution Euroclone ECM0507L
HBSS (10X), no calcium, no magnesium, no phenol red ThermoFisher Scientific 14185045
HyClone Characterized Fetal Bovine Serum (U.S.) Cytiva SH30071.03
Incucyte, Neurotrack Analysis Software  Sartorius 9600-0010
L-15 Medium (Leibovitz) Millipore/Sigma L5520
Laminin Mouse Protein, Natural ThermoFisher Scientific 23017015
L-Cysteine Merck / Sigma C7352
Leibovitz's L-15 medium w/o L-glutamine Euroclone ECB0020L
mouse NGF 2.5S (>95%) Alomone Labs N-100
Neurobasal Medium [-] Glutamine ThermoFisher Scientific 21103049
NSC-34 CELLutions Biosystems Inc (Ontario, Canada) CLU140
Papain from papaya latex Sigma P4762
Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL) ThermoFisher Scientific 15070063
Percoll (Density 1.130 g/mL) Cytiva 17089101
Poly-D-Lysine Solution (1mg/mL) EMD Millipore/Merck A-003-E
Poly-L-Lysine Solution (0-01%) Sigma P4832
Recombinant Human NT-3 PeproTech 450-03
Retinoic Acid Merck / Sigma R2625
Trypsin-EDTA solution Sigma T3924
β-Tubulin III (Tuj1) antibody Merck / Sigma T8660

Referencias

  1. Terenzio, M., et al. Locally translated mTOR controls axonal local translation in nerve injury. Science. 359, 1416-1421 (2018).
  2. Marvaldi, L., et al. Enhanced axon outgrowth and improved long-distance axon regeneration in sprouty2 deficient mice. Dev Neurobiol. 75, 217-231 (2015).
  3. Kalinski, A. L., et al. Deacetylation of Miro1 by HDAC6 blocks mitochondrial transport and mediates axon growth inhibition. J Cell Biol. 218, 1871-1890 (2019).
  4. Marvaldi, L., et al. Importin α3 regulates chronic pain pathways in peripheral sensory neurons. Science. 369, 842-846 (2020).
  5. Gangadharan, V., et al. Neuropathic pain caused by miswiring and abnormal end organ targeting. Nature. 606, 137-145 (2022).
  6. Testa, L., Dotta, S., Vercelli, A., Marvaldi, L., et al. Communicating pain: emerging axonal signaling in peripheral neuropathic pain. Front Neuroanat. 18, (2024).
  7. Thongrong, S., et al. Sprouty2 and -4 hypomorphism promotes neuronal survival and astrocytosis in a mouse model of kainic acid induced neuronal damage. Hippocampus. 26, 658-667 (2016).
  8. Yaron, A., Schuldiner, O. Common and divergent mechanisms in developmental neuronal remodeling and dying back neurodegeneration. Curr Biol. 26, R628-R639 (2016).
  9. Maor-Nof, M., et al. Axonal degeneration is regulated by a transcriptional program that coordinates expression of pro- and anti-degenerative factors. Neuron. 92, 991-1006 (2016).
  10. Bromberg, K. D. Regulation of neurite outgrowth by Gi/o signaling pathways. Front Biosci. 13, 4544-4557 (2008).
  11. Girouard, M. P., et al. Collapsin response mediator protein 4 (CRMP4) facilitates wallerian degeneration and axon regeneration following Sciatic nerve injury. eNeuro. 7, 0479-0419 (2020).
  12. van Erp, S., et al. Age-related loss of axonal regeneration is reflected by the level of local translation. Exp Neurol. 339, 113594 (2021).
  13. Wang, X., et al. Driving axon regeneration by orchestrating neuronal and non-neuronal innate immune responses via the IFNγ-cGAS-STING axis. Neuron. 111, 236-255.e7 (2023).
  14. Kaselis, A., Treinys, R., Vosyliūtė, R., Šatkauskas, S. DRG axon elongation and growth cone collapse rate induced by Sema3A are differently dependent on NGF concentration. Cell Mol Neurobiol. 34, 289-296 (2014).
  15. Maier, O., et al. Differentiated NSC-34 motoneuron-like cells as experimental model for cholinergic neurodegeneration. Neurochem Int. 62, 1029-1038 (2013).
  16. Nango, H., et al. Highly efficient conversion of motor neuron-like NSC-34 cells into functional motor neurons by Prostaglandin E2. Cells. 9, 1741 (2020).
  17. Kim, H. W., Caspar, T., Shah, S. B., Hsieh, A. H. Effects of proinflammatory cytokines on axonal outgrowth from adult rat lumbar dorsal root ganglia using a novel three-dimensional culture system. Spine J. 15, 1823-1831 (2015).
  18. Frey, E., et al. An in vitro assay to study induction of the regenerative state in sensory neurons. Exp Neurol. 263, 350-363 (2015).
  19. Zhang, Z., et al. Cerebellar injury and impaired function in a rabbit model of maternal inflammation induced neonatal brain injury. Neurobiol Learn Mem. 165, 106901 (2019).
  20. Pemberton, K., Mersman, B., Xu, F. Using ImageJ to assess neurite outgrowth in mammalian cell cultures: Research data quantification exercises in undergraduate neuroscience lab. J Undergrad Neurosci Educ. 16, A186-A194 (2018).
  21. Marvaldi, L., Hausott, B., Auer, M., Leban, J., Klimaschewski, L. A Novel DRAK inhibitor, SC82510, promotes axon branching of adult sensory neurons in vitro. Neurochem Res. 39, 403-407 (2014).
  22. Quarta, S., et al. Peripheral nerve regeneration and NGF-dependent neurite outgrowth of adult sensory neurons converge on STAT3 phosphorylation downstream of neuropoietic cytokine receptor gp130. J Neurosci. 34, 13222-13233 (2014).
  23. Woitke, F., et al. Adult hippocampal neurogenesis poststroke: More new granule cells but aberrant morphology and impaired spatial memory. PLoS One. 12, e0183463 (2017).
  24. Xiao, X., et al. Automated dendritic spine detection using convolutional neural networks on maximum intensity projected microscopic volumes. J Neurosci Meth. 309, 25-34 (2018).
  25. Pool, M., Thiemann, J., Bar-Or, A., Fournier, A. E. NeuriteTracer: A novel ImageJ plugin for automated quantification of neurite outgrowth. J Neurosci Meth. 168, 134-139 (2008).
  26. Wang, D., et al. HCA-Vision: Automated neurite outgrowth analysis. SLAS Disc. 15, 1165-1170 (2010).
  27. Whitlon, D. S., et al. Novel high content screen detects compounds that promote neurite regeneration from cochlear spiral ganglion neurons. Sci Rep. 5, 15960 (2015).
  28. Rishal, I., et al. WIS-neuromath enables versatile high throughput analyses of neuronal processes. Dev Neurobiol. 73, 247-256 (2013).
  29. Smith, D. S., Pate Skene, J. H. A Transcription-dependent switch controls competence of adult neurons for distinct modes of axon growth. J Neurosci. 17, 646-658 (1997).
  30. Gardiner, N. J., et al. Preconditioning injury-induced neurite outgrowth of adult rat sensory neurons on fibronectin is mediated by mobilisation of axonal α5 integrin. Mol Cell Neurosci. 35, 249-260 (2007).
  31. Hauck, J. S., et al. Heat shock factor 1 directly regulates transsulfuration pathway to promote prostate cancer proliferation and survival. Commun Biol. 7, 9 (2024).
  32. Zhu, Y., et al. Loss of WIPI4 in neurodegeneration causes autophagy-independent ferroptosis. Nat Cell Biol. 26, 542-551 (2024).
  33. Reggiani, F., et al. BET inhibitors drive Natural Killer activation in non-small cell lung cancer via BRD4 and SMAD3. Nat Commun. 15, 2567 (2024).
  34. Ackerman, H. D., Gerhard, G. S. Bile acids induce neurite outgrowth in NSC-34 cells via TGR5 and a distinct transcriptional profile. Pharmaceuticals. 16, 174 (2023).
  35. Tuttle, R., Matthew, W. D. Neurotrophins affect the pattern of DRG neurite growth in a bioassay that presents a choice of CNS and PNS substrates. Development. 121, 1301-1309 (1995).
  36. Wurster, S., et al. Live monitoring and analysis of fungal growth, viability, and mycelial morphology using the IncuCyte NeuroTrack processing module. mBio. 10 (3), e00673-e00619 (2019).

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Citar este artículo
Musso, G., Dotta, S., Parmar, A., Rasà, D. M., Di Cunto, F., Marvaldi, L. Standardization of a Novel Semi-Automatic Software for Neurite Outgrowth Measurement . J. Vis. Exp. (210), e67163, doi:10.3791/67163 (2024).

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