Padronização de um novo software semiautomático para medição de crescimento de neuritos

Nos nervos ciáticos, é possível medir a regeneração axonal¹. Além disso, estudos in vitro mostraram a viabilidade de monitorar o crescimento axonal ^2,3 para compreender suas várias fases, desde o brotamento axonal até a degeneração axonal, em neurônios saudáveis e lesionados. Ao rastrear esses processos, é possível medir parâmetros como polaridade axonal, iniciação, estabilidade e ramificação. Este último parâmetro é crucial para entender a percepção da dor neuropática ^4,5,6. Da mesma forma, a degeneração axonal pode ser monitorada in vivo⁷ ou in vitro ^8,9. Durante o crescimento dos neuritos, as redes de citoesqueleto de actina e microtúbulos se estabilizam ou mudam de acordo com as necessidades da célula¹⁰. O citoesqueleto de actina se reorganiza para permitir a formação do cone de crescimento axonal, e os microtúbulos se realinham em feixes para estabilizar o neurite em crescimento¹¹. Para estudar o crescimento de neuritos de neurônios centrais e periféricos in vitro, três parâmetros comuns são quantificados: comprimento axonal total, distância máxima e pontos de ramificação. Esses parâmetros são usados para estudar a resposta do crescimento neuronal ao tratamento (ou seja, neurotrofinas, compostos, inibidores, ácido retinóico, siRNA, shRNA) ou em animais geneticamente modificados 12,13,14. Para avaliar se os neurônios têm neurites mais alongados e/ou mais ramificações, esses três parâmetros nos permitem avaliar a morfologia de um neurônio. A medição do comprimento de neuritos é o parâmetro de maior interesse em várias configurações experimentais in vitro. A partir dos gânglios da raiz dorsal, são realizados principalmente dois tipos de culturas: cultura in vitro dissociada ou cultura organotípica de explantes DRG inteiros. Em ambos os casos, o comprimento dos neuritos é um parâmetro ouro para avaliar o resultado do experimento. Em uma linhagem celular semelhante a neurônios motores (NSC-34), o crescimento axonal e a ramificação são medidos após a diferenciação induzida pelo ácido retinóico^15,16. De fato, medindo o crescimento dos neuritos, é possível determinar se um tratamento específico funcionou¹⁷, a taxa de crescimento¹⁸ ou a capacidade de regeneração após um procedimento de lesão¹⁹.

Como avaliar adequadamente o crescimento de neuritos apresentou um número significativo de desafios ao longo dos anos no campo da pesquisa. No entanto, não há padronização das medições do comprimento dos neuritos. Alguns dos métodos mais utilizados para culturas de células in vitro são, por exemplo, o plug-in manual NeuronJ em Fiji^18,20 ou MetaMorph^21,23 e o semiautomático Neurolucida^23,24. Além das metodologias manuais, também existem métodos automáticos, como o plug-in NeuriteTracer no Fiji²⁵, o software HCA Vision^26,27 ou o WIS-NeuroMath ^2,28. Outras metodologias menos precisas dependem da medição da dimensão geral dos neurônios. Esses métodos incluem a medição da distância do vetor do corpo celular até a ponta do axônio mais longo²⁹ ou a análise de Sholl³⁰. No entanto, esses métodos de medição são adequados para culturas de densidade muito baixa ou neurônios únicos. Além disso, todas essas metodologias são utilizadas principalmente em neurônios corados ou neurônios que expressam fluoróforos geneticamente codificados (ou seja, GFP, Vênus, mCherry). O tipo de neurônio e a densidade da cultura de células afetam profundamente a escolha da metodologia de medição. Por exemplo, segmentar manualmente neurônios com morfologias muito intrincadas e complicadas, como neurônios DRG, pode facilmente se tornar uma tarefa impossível. Se os neurônios complicados já são um desafio para segmentar, as redes neurais estão completamente fora do alcance de abordagens manuais devido à sua organização altamente complexa.

Por um lado, a segmentação manual é muito precisa porque é realizada pelos olhos e pela inteligência humana; por outro lado, é realmente demorado. O elevado gasto de tempo exigido pelos métodos manuais é a principal desvantagem. Por esse motivo, apenas alguns neurônios são adquiridos para análise, tornando-a menos precisa e dispendiosa em termos de tempo. As abordagens automáticas ou semiautomáticas, por outro lado, reduzem parcialmente o gasto de tempo. No entanto, eles também têm algumas desvantagens. Os métodos automáticos precisam ser treinados para funcionar corretamente e, se o software não for interativo o suficiente com o usuário, a segmentação pode estar errada.

Além da medição do crescimento de neuritos, o número de pontos de ramificação também é uma informação valiosa. Com a segmentação manual, o número de pontos de ramificação pode ser calculado, enquanto isso não é possível com uma distância vetorial. Com métodos automáticos, o número de pontos de ramificação geralmente é fornecido, enquanto com a análise de Sholl, ele deve ser calculado com uma fórmula matemática.

Neste artigo de métodos, pretendemos descrever a funcionalidade e eficácia deste software semiautomático na medição do comprimento axonal total e outros parâmetros. A máquina permite a aquisição automática de imagens em pontos de tempo definidos ou a realização de estudos de longo prazo (dias, semanas, meses), preservando um ambiente fisiológico para células vivas. A medição do crescimento de neuritos usando imagens de lapso de tempo com contraste de fase tem o benefício de permitir o monitoramento contínuo da cinética e do crescimento dos neuritos. Além disso, também é possível monitorar a morte celular por meio da adição no meio de corantes específicos que têm como alvo as células mortas 31,32,33. Embora o software tenha sido lançado em 2012, somos os primeiros a padronizar essa metodologia de forma reprodutível e imparcial para a quantificação precisa do crescimento de neuritos. No entanto, é importante observar que o software não está incluído na compra da máquina. Apesar desse gasto adicional, seu uso oferece vantagens significativas na medição do comprimento axonal total e outros parâmetros, contribuindo assim para a pesquisa no campo da neurociência.