Summary

用于神经突生长测量的新型半自动软件的标准化

Published: August 09, 2024
doi:

Summary

神经突生长测定提供了有关再生神经元过程的定量值。这种半自动软件的优点是它通过创建掩码分别分割细胞体和神经突,并测量各种参数,例如神经突长度、分支点数量、细胞体簇面积和细胞簇数量。

Abstract

有效的实时成像技术对于评估神经元形态以实时测量神经突生长至关重要。多年来,正确测量神经突生长物一直是神经科学研究领域的一个长期挑战。该参数是许多 体外 实验设置的基础,范围从解离培养物和器官型培养物到细胞系。通过量化神经突长度,可以确定特定治疗是否有效,或者不同实验组中的轴突再生是否增强。本研究旨在证明 Incucyte® Neurotrack 神经突生长分析软件的稳健性和准确性。这种半自动软件可用于延时显微镜系统,与常用方法相比,它在量化相差图像中的神经突长度方面具有多项优势。该算法对每张图像中的多个参数进行屏蔽和量化,并返回神经元细胞指标,包括神经突长度、分支点、细胞-体簇和细胞-体簇区域。首先,我们通过将软件的值与斐济插件手动 NeuronJ 的值相关联,验证了该软件的稳健性和准确性。其次,我们使用的算法能够同时处理相差图像和免疫细胞化学图像。使用特异性神经元标志物,我们验证了在 体外 培养中感觉神经元上基于荧光的神经突生长分析的可行性。此外,该软件可以测量各种接种条件下的神经突长度,从单个细胞到复杂的神经元网。总之,该软件为神经突生长测定提供了一个创新且高效的平台,为更快、更可靠的定量铺平了道路。

Introduction

在坐骨神经中,可以测量轴突再生1 (axonal regenerations)。此外,体外研究表明,在健康和受伤神经元中监测轴突生长 2,3 以理解其各个阶段(从轴突发芽到轴突变性)的可行性。通过跟踪这些过程,可以测量轴突极性、起始、稳定性和分支等参数。最后一个参数对于理解神经性疼痛感知至关重要 4,5,6。同样,轴突变性可以在体内7 体外监测 8,9在神经突生长过程中,肌动蛋白和微管细胞骨架网络稳定或根据细胞的需要发生变化10。肌动蛋白细胞骨架重组以允许形成轴突生长锥,微管重新排列成束以稳定生长的神经突11。为了在体外研究中枢和外周神经元的神经突生长,量化了三个常见参数:总轴突长度、最大距离和分支点。这些参数用于研究神经元生长对治疗(即神经营养因子、化合物、抑制剂、视黄酸、siRNA、shRNA)或转基因动物的反应 12,13,14。为了评估神经元是否具有更细长的神经突和/或更多的分支,这三个参数使我们能够评估神经元的形态。神经突长度测量是几种体外实验装置中最受关注的参数。从背根神经节,主要进行两种类型的培养:解离体外培养或整个 DRG 外植体的器官型培养。在任何一种情况下,神经突长度都是评估实验结果的黄金参数。在运动神经元样细胞系 (NSC-34) 中,在视黄酸诱导分化后测量轴突生长和分支15,16。事实上,通过测量神经突生长物,可以确定特定治疗是否有效17、生长速率18 或受伤手术后的再生能力19

多年来,如何正确评估神经突生长在研究领域带来了大量挑战。然而,神经突长度测量没有标准化。体外细胞培养的一些最常用的方法是,例如,Fiji18,20 或 MetaMorph21,23 上的手动 NeuronJ 插件以及半自动 Neurolucida23,24除了手动方法外,还有自动方法,例如 Fiji25 上的 NeuriteTracer 插件、HCA Vision 软件26,27 或 WIS-NeuroMath 2,28其他不太准确的方法依赖于对神经元整体维度的测量。这些方法包括测量从细胞体到最长轴突尖端的矢量距离29 或 Sholl 分析30。然而,这些测量方法适用于非常低密度的培养物或单个神经元。此外,所有这些方法主要用于染色神经元或表达遗传编码荧光团(即 GFP、Venus、mCherry)的神经元。神经元的类型和细胞培养物的密度会严重影响测量方法的选择。例如,手动分割形态非常复杂和复杂的神经元,例如 DRG 神经元,很容易成为一项不可能完成的任务。如果说复杂多曲折的神经元已经是一个难以分割的挑战,那么由于神经网络的组织高度复杂,手动方法完全无法实现。

一方面,人工分割非常精确,因为它是由人眼和智能执行的;另一方面,它真的很耗时。手动方法需要增加的时间消耗是主要缺点。因此,仅获取少量神经元进行分析,使其准确性较低且时间成本较高。另一方面,自动或半自动方法部分减少了时间消耗。但是,它们也有一些缺点。需要训练自动方法才能正常工作,如果软件与用户的交互性不够,则分割可能会出错。

除了神经突生长测量外,分支点的数量也是有价值的信息。使用手动分割,可以计算分支点的数量,而使用矢量距离则无法计算。使用自动方法,通常会提供分支点的数量,而使用 Sholl 分析,则必须使用数学公式进行计算。

在该方法论文中,我们旨在描述这种半自动软件在测量总轴突长度和其他参数方面的功能和有效性。该机器允许在定义的时间点自动采集图像或进行长期研究(几天、几周、几个月),为活细胞保留生理环境。使用相差延时成像测量神经突生长的好处是可以连续监测神经突动力学和生长。此外,还可以通过在培养基中添加靶向死细胞的特异性染料来监测细胞死亡 31,32,33。尽管该软件已于 2012 年发布,但我们是第一个以可重复和无偏见的方式标准化该方法以准确量化神经突生长的公司。但是,请务必注意,该软件不包含在购买机器中。尽管有这笔额外的费用,但它的使用在测量总轴突长度和其他参数方面具有显着优势,从而有助于神经科学领域的研究。

Protocol

1. 扫描机器上的容器 注意:检测由内置的 Basler Ace 1920-155 μm 相机执行。 单击 Connect to Device 并选择 Schedule – To Acquire,打开程序。然后点击 + 号。 通过分别选择选项 Scan on Schedule (按计划扫描 ) 或 Scan Once Now (立即扫描一次) 来指定船舶是重复扫描还是仅扫…

Representative Results

神经突生长测量算法能够稳健地检测神经网络和单个神经元中的神经突。它生成一个黄色遮罩,用于分割具有高对比度的对象,例如细胞体、细胞碎片、死细胞、组织外植体和阴影。此外,洋红色面具出现在不同厚度的神经突上。神经突长度值以 mm/mm2 为单位提供,表示轴突长度已除以图像面积,即 0.282739 mm2 并且对于每个扫描条件都是恒定的。因此,为?…

Discussion

准确测量神经元在健康、受伤和患病条件下的生长情况是神经科学领域内许多实验装置的关键参数。无论是使用整个 DRG 外植体的器官型培养物还是解离培养物,正确测量轴突生长在过去 20 年中都是一项重大挑战。如果没有可靠和准确的神经突生长定量,就无法评估特定治疗是否有效,例如针对 NSC-34 细胞34 的视黄酸(4 天)或胚胎 DRG 神经元的神经营养…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

我们要感谢 Alessandro Vercelli 的批评意见和 Sartorius 的技术支持。我们对这些主题的研究得到了 2021 年 Rita-Levi Montalcini Grant(意大利 MIUR)的慷慨支持。这项研究由 Ministero dell’Istruzione dell’Università e della Ricerca MIUR 项目 Dipartimenti di Eccellenza 2023-2027 资助给神经科学系 Rita Levi Montalcini。D.M.R. 的研究是在意大利国家可持续发展和气候变化大学间博士课程(链接:www.phd-sdc.it)期间并得到其支持。

Materials

Collagenase A Merck / Roche 10103586001
Dispase II (neutral protease, grade II) Merck / Roche 4942078001
Dulbecco's modified eagle's medium Merck / Sigma D5796
Fetal bovin serum  Merck / Sigma F7524
Ham's F-12 Nutrient Mix (1X) ThermoFisher Scientific 21765029
Ham's F12 w/ L-Glutamine Euroclone ECM0135L
Hanks' Balanced Salt Solution Euroclone ECM0507L
HBSS (10X), no calcium, no magnesium, no phenol red ThermoFisher Scientific 14185045
HyClone Characterized Fetal Bovine Serum (U.S.) Cytiva SH30071.03
Incucyte, Neurotrack Analysis Software  Sartorius 9600-0010
L-15 Medium (Leibovitz) Millipore/Sigma L5520
Laminin Mouse Protein, Natural ThermoFisher Scientific 23017015
L-Cysteine Merck / Sigma C7352
Leibovitz's L-15 medium w/o L-glutamine Euroclone ECB0020L
mouse NGF 2.5S (>95%) Alomone Labs N-100
Neurobasal Medium [-] Glutamine ThermoFisher Scientific 21103049
NSC-34 CELLutions Biosystems Inc (Ontario, Canada) CLU140
Papain from papaya latex Sigma P4762
Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL) ThermoFisher Scientific 15070063
Percoll (Density 1.130 g/mL) Cytiva 17089101
Poly-D-Lysine Solution (1mg/mL) EMD Millipore/Merck A-003-E
Poly-L-Lysine Solution (0-01%) Sigma P4832
Recombinant Human NT-3 PeproTech 450-03
Retinoic Acid Merck / Sigma R2625
Trypsin-EDTA solution Sigma T3924
β-Tubulin III (Tuj1) antibody Merck / Sigma T8660

References

  1. Terenzio, M., et al. Locally translated mTOR controls axonal local translation in nerve injury. Science. 359, 1416-1421 (2018).
  2. Marvaldi, L., et al. Enhanced axon outgrowth and improved long-distance axon regeneration in sprouty2 deficient mice. Dev Neurobiol. 75, 217-231 (2015).
  3. Kalinski, A. L., et al. Deacetylation of Miro1 by HDAC6 blocks mitochondrial transport and mediates axon growth inhibition. J Cell Biol. 218, 1871-1890 (2019).
  4. Marvaldi, L., et al. Importin α3 regulates chronic pain pathways in peripheral sensory neurons. Science. 369, 842-846 (2020).
  5. Gangadharan, V., et al. Neuropathic pain caused by miswiring and abnormal end organ targeting. Nature. 606, 137-145 (2022).
  6. Testa, L., Dotta, S., Vercelli, A., Marvaldi, L., et al. Communicating pain: emerging axonal signaling in peripheral neuropathic pain. Front Neuroanat. 18, (2024).
  7. Thongrong, S., et al. Sprouty2 and -4 hypomorphism promotes neuronal survival and astrocytosis in a mouse model of kainic acid induced neuronal damage. Hippocampus. 26, 658-667 (2016).
  8. Yaron, A., Schuldiner, O. Common and divergent mechanisms in developmental neuronal remodeling and dying back neurodegeneration. Curr Biol. 26, R628-R639 (2016).
  9. Maor-Nof, M., et al. Axonal degeneration is regulated by a transcriptional program that coordinates expression of pro- and anti-degenerative factors. Neuron. 92, 991-1006 (2016).
  10. Bromberg, K. D. Regulation of neurite outgrowth by Gi/o signaling pathways. Front Biosci. 13, 4544-4557 (2008).
  11. Girouard, M. P., et al. Collapsin response mediator protein 4 (CRMP4) facilitates wallerian degeneration and axon regeneration following Sciatic nerve injury. eNeuro. 7, 0479-0419 (2020).
  12. van Erp, S., et al. Age-related loss of axonal regeneration is reflected by the level of local translation. Exp Neurol. 339, 113594 (2021).
  13. Wang, X., et al. Driving axon regeneration by orchestrating neuronal and non-neuronal innate immune responses via the IFNγ-cGAS-STING axis. Neuron. 111, 236-255.e7 (2023).
  14. Kaselis, A., Treinys, R., Vosyliūtė, R., Šatkauskas, S. DRG axon elongation and growth cone collapse rate induced by Sema3A are differently dependent on NGF concentration. Cell Mol Neurobiol. 34, 289-296 (2014).
  15. Maier, O., et al. Differentiated NSC-34 motoneuron-like cells as experimental model for cholinergic neurodegeneration. Neurochem Int. 62, 1029-1038 (2013).
  16. Nango, H., et al. Highly efficient conversion of motor neuron-like NSC-34 cells into functional motor neurons by Prostaglandin E2. Cells. 9, 1741 (2020).
  17. Kim, H. W., Caspar, T., Shah, S. B., Hsieh, A. H. Effects of proinflammatory cytokines on axonal outgrowth from adult rat lumbar dorsal root ganglia using a novel three-dimensional culture system. Spine J. 15, 1823-1831 (2015).
  18. Frey, E., et al. An in vitro assay to study induction of the regenerative state in sensory neurons. Exp Neurol. 263, 350-363 (2015).
  19. Zhang, Z., et al. Cerebellar injury and impaired function in a rabbit model of maternal inflammation induced neonatal brain injury. Neurobiol Learn Mem. 165, 106901 (2019).
  20. Pemberton, K., Mersman, B., Xu, F. Using ImageJ to assess neurite outgrowth in mammalian cell cultures: Research data quantification exercises in undergraduate neuroscience lab. J Undergrad Neurosci Educ. 16, A186-A194 (2018).
  21. Marvaldi, L., Hausott, B., Auer, M., Leban, J., Klimaschewski, L. A Novel DRAK inhibitor, SC82510, promotes axon branching of adult sensory neurons in vitro. Neurochem Res. 39, 403-407 (2014).
  22. Quarta, S., et al. Peripheral nerve regeneration and NGF-dependent neurite outgrowth of adult sensory neurons converge on STAT3 phosphorylation downstream of neuropoietic cytokine receptor gp130. J Neurosci. 34, 13222-13233 (2014).
  23. Woitke, F., et al. Adult hippocampal neurogenesis poststroke: More new granule cells but aberrant morphology and impaired spatial memory. PLoS One. 12, e0183463 (2017).
  24. Xiao, X., et al. Automated dendritic spine detection using convolutional neural networks on maximum intensity projected microscopic volumes. J Neurosci Meth. 309, 25-34 (2018).
  25. Pool, M., Thiemann, J., Bar-Or, A., Fournier, A. E. NeuriteTracer: A novel ImageJ plugin for automated quantification of neurite outgrowth. J Neurosci Meth. 168, 134-139 (2008).
  26. Wang, D., et al. HCA-Vision: Automated neurite outgrowth analysis. SLAS Disc. 15, 1165-1170 (2010).
  27. Whitlon, D. S., et al. Novel high content screen detects compounds that promote neurite regeneration from cochlear spiral ganglion neurons. Sci Rep. 5, 15960 (2015).
  28. Rishal, I., et al. WIS-neuromath enables versatile high throughput analyses of neuronal processes. Dev Neurobiol. 73, 247-256 (2013).
  29. Smith, D. S., Pate Skene, J. H. A Transcription-dependent switch controls competence of adult neurons for distinct modes of axon growth. J Neurosci. 17, 646-658 (1997).
  30. Gardiner, N. J., et al. Preconditioning injury-induced neurite outgrowth of adult rat sensory neurons on fibronectin is mediated by mobilisation of axonal α5 integrin. Mol Cell Neurosci. 35, 249-260 (2007).
  31. Hauck, J. S., et al. Heat shock factor 1 directly regulates transsulfuration pathway to promote prostate cancer proliferation and survival. Commun Biol. 7, 9 (2024).
  32. Zhu, Y., et al. Loss of WIPI4 in neurodegeneration causes autophagy-independent ferroptosis. Nat Cell Biol. 26, 542-551 (2024).
  33. Reggiani, F., et al. BET inhibitors drive Natural Killer activation in non-small cell lung cancer via BRD4 and SMAD3. Nat Commun. 15, 2567 (2024).
  34. Ackerman, H. D., Gerhard, G. S. Bile acids induce neurite outgrowth in NSC-34 cells via TGR5 and a distinct transcriptional profile. Pharmaceuticals. 16, 174 (2023).
  35. Tuttle, R., Matthew, W. D. Neurotrophins affect the pattern of DRG neurite growth in a bioassay that presents a choice of CNS and PNS substrates. Development. 121, 1301-1309 (1995).
  36. Wurster, S., et al. Live monitoring and analysis of fungal growth, viability, and mycelial morphology using the IncuCyte NeuroTrack processing module. mBio. 10 (3), e00673-e00619 (2019).

Play Video

Cite This Article
Musso, G., Dotta, S., Parmar, A., Rasà, D. M., Di Cunto, F., Marvaldi, L. Standardization of a Novel Semi-Automatic Software for Neurite Outgrowth Measurement . J. Vis. Exp. (210), e67163, doi:10.3791/67163 (2024).

View Video