Sistema de síntese de proteínas livres de células para a construção de células sintéticas

A síntese de células sintéticas ou artificiais emergiu como um campo altamente proeminente de pesquisa interdisciplinar, atraindo interesse substancial de cientistas nos domínios da biologia sintética, química e biofísica. Esses cientistas estão unidos pelo objetivo comum de construir uma célula viva mínima ^1,2,3. O rápido crescimento deste campo tem estado em sintonia com avanços significativos em tecnologias críticas, como manipulação de DNA recombinante⁴, materiais biomiméticos⁵ e técnicas de microfabricação para compartimentalização⁶, incluindo o método Cell-Free Protein Synthesis (CFPS)⁷. Os sistemas CFPS abrangem a maquinaria celular essencial para transcrição e tradução, fornecendo a estrutura fundamental para o desenvolvimento e integração de células artificiais multifuncionais.

Embora as técnicas de CFPS sejam frequentemente usadas na montagem de células sintéticas, o desenvolvimento de um sistema CFPS robusto e personalizado para a montagem de vários sistemas de células sintéticas continua sendo um desafio complexo. Atualmente, vários sistemas CFPS estão disponíveis, derivados de organismos modelo procariotos e eucariotos⁸, cada um especializado para aplicações específicas na síntese de células sintéticas. Além de seus papéis centrais na transcrição e tradução, os sistemas CFPS variam em seus principais componentes e procedimentos de preparação associados. Essas variações, que incluem diferenças em extratos celulares, RNA polimerases, métodos de preparação de moldes e composições de tampão, são em grande parte devidas às distintas trajetórias de desenvolvimento perseguidas por grupos de pesquisa que otimizaram intensamente seus sistemas para obter o máximo rendimento de proteínas.

Entre os vários componentes do sistema CFPS, o extrato celular é um pool enzimático crítico para transcrição e tradução e, portanto, um determinante chave do desempenho do CFPS⁹. A CFPS baseada em Escherichia coli (E. coli) é o sistema mais comumente utilizado devido ao seu status como o organismo procariótico mais bem compreendido. Além disso, um sistema CFPS totalmente reconstituído composto por proteínas e ribossomos purificados individualmente, conhecido como PURE¹⁰, foi desenvolvido pelo grupo de pesquisa de Ueda, que é particularmente adequado para aplicações que exigem um fundo claro. Hoje, até mesmo os sistemas CFPS baseados em E. coli se diversificaram, especialmente em termos de cepas de origem para o extrac¹¹ e métodos de preparação^12,13, RNA polimerase^14,15, fontes de energia^16,17 e sistemas tampão^18,19. As cepas mais usadas incluem derivados de cepas K12 e B, como A19²⁰, JM109²¹, BL21 (DE3)²² e Rossetta2²³, juntamente com suas contrapartes geneticamente modificadas.

Inicialmente, cepas de E. coli com atividades reduzidas de RNase e protease foram escolhidas para aumentar a estabilidade do mRNA e a estabilidade de proteínas recombinantes recém-sintetizadas, levando ao aumento da produção final de proteínas²⁴. Posteriormente, os extratos de E. coli foram projetados para facilitar modificações pós-traducionais específicas, incluindo glicosilação²⁵, fosforilação²⁶ e lipidação²⁷, foram desenvolvidos para alcançar as modificações pós-traducionais acima. Além disso, uma série de aditivos, como chaperons moleculares²⁸ e estabilizadores químicos, foram incorporados para auxiliar no dobramento de proteínas-alvo, contribuindo para a diversificação dos sistemas CFPS. A RNA polimerase do bacteriófago T7, conhecida por sua alta processividade, é predominantemente empregada para transcrição, embora outras polimerases como a SP6²⁹ também tenham sido utilizadas. A RNA polimerase endógena de E. coli foi adaptada para a prototipagem de circuitos genéticos alavancando fatores sigma³⁰. Por fim, uma variedade de precursores de energia 31,32,33 e diferentes sais e componentes tampão 19,34,35 foram sistematicamente otimizados para aumentar a produtividade.

Além do próprio sistema CFPS, os métodos de encapsulamento, bem como os materiais de compartimentalização, também são vitais para a montagem bem-sucedida de células sintéticas. Vários sistemas que foram desenvolvidos para encapsular com sucesso a reação CFPS incluem gotículas de água/óleo estabilizadas com surfactante, lipídios/polímeros e suas vesículas unilamelares híbridas (com diâmetros variando de 50 nm a vários μm), bem como bicamadas lipídicas suportadas por planos. No entanto, devido ao conteúdo de moléculas complexadas do sistema CFPS, a taxa de sucesso do encapsulamento depende de casos específicos, particularmente para a formação de vesículas. Para melhorar a taxa de sucesso e a eficiência do encapsulamento da CFPS, vários chips de microfluidos foram desenvolvidos para facilitar a formação de gotículas e vesículas³⁶. No entanto, chips e dispositivos adicionais precisarão ser estabelecidos.

Este protocolo delineia um sistema CFPS de E. coli utilizando a cepa BL21 (DE3), que é um hospedeiro comumente empregado para a produção de proteínas recombinantes. O protocolo abrange um relato detalhado da preparação do extrato celular, preparação do molde e otimização da expressão padrão usando uma proteína repórter fluorescente. Além disso, apresentamos resultados exemplares alcançados encapsulando o sistema CFPS em diversos microcompartimentos, incluindo gotículas de monocamada, vesículas de emulsão dupla e câmaras situadas sobre bicamadas lipídicas suportadas. Por fim, expomos os elementos processuais fundamentais e as condições necessárias indispensáveis para o estabelecimento bem-sucedido desses sistemas de CFPS em contextos ambientais distintos.