Zellfreies Proteinsynthesesystem für den Aufbau synthetischer Zellen

Die Synthese synthetischer oder künstlicher Zellen hat sich zu einem sehr prominenten Bereich der interdisziplinären Forschung entwickelt, der erhebliches Interesse von Wissenschaftlern aus allen Bereichen der synthetischen Biologie, Chemie und Biophysik auf sich zieht. Die Wissenschaftler eint das gemeinsame Ziel, eine minimale lebende Zelle zu konstruieren ^1,2,3. Das schnelle Wachstum dieses Gebiets ging einher mit bedeutenden Fortschritten bei kritischen Technologien, wie z. B. der rekombinanten DNA-Manipulation⁴, biomimetischen Materialien⁵ und Mikrofabrikationstechniken für die Kompartimentierung⁶, einschließlich der Methode der zellfreien Proteinsynthese (CFPS)⁷. CFPS-Systeme umfassen die wesentliche zelluläre Maschinerie für die Transkription und Translation und bilden den grundlegenden Rahmen für die Entwicklung und Integration multifunktionaler künstlicher Zellen.

Obwohl CFPS-Techniken häufig bei der Assemblierung von synthetischen Zellen eingesetzt werden, bleibt die Entwicklung eines robusten und maßgeschneiderten CFPS-Systems für die Assemblierung verschiedener synthetischer Zellsysteme eine komplexe Herausforderung. Derzeit stehen zahlreiche CFPS-Systeme zur Verfügung, die sowohl von Prokaryoten als auch von Eukaryoten-Modellorganismen^{abgeleitet sind 8}, die jeweils auf bestimmte Anwendungen in der synthetischen Zellsynthese spezialisiert sind. Abgesehen von ihrer zentralen Rolle bei der Transkription und Translation unterscheiden sich CFPS-Systeme in ihren Hauptkomponenten und den damit verbundenen Präparationsverfahren. Diese Variationen, zu denen Unterschiede in Zellextrakten, RNA-Polymerasen, Template-Präparationsmethoden und Pufferzusammensetzungen gehören, sind größtenteils auf die unterschiedlichen Entwicklungspfade zurückzuführen, die von Forschungsgruppen verfolgt werden, die ihre Systeme intensiv für eine maximale Proteinausbeute optimiert haben.

Unter den verschiedenen Komponenten des CFPS-Systems ist der Zellextrakt ein kritischer enzymatischer Pool für die Transkription und Translation und damit eine Schlüsseldeterminante für die CFPS-Leistung⁹. Das auf Escherichia coli (E. coli) basierende CFPS ist aufgrund seines Status als der am besten verstandene prokaryotische Organismus das am häufigsten verwendete System. Darüber hinaus hat Uedas Forschungsgruppe ein vollständig rekonstituiertes CFPS-System aus einzeln gereinigten Proteinen und Ribosomen entwickelt, bekannt als PURE¹⁰, das sich besonders für Anwendungen eignet, die einen klaren Hintergrund erfordern. Heute haben sich sogar E. coli-basierte CFPS-Systeme diversifiziert, insbesondere in Bezug auf die Ausgangsstämme für das extrac¹¹ und die Präparationsmethoden^12,13, die RNA-Polymerase^14,15, die Energiequellen^16,17 und die Puffersysteme^18,19. Zu den am häufigsten verwendeten Stämmen gehören neben ihren gentechnisch veränderten Pendants K12- und B-Stammderivate wie A19²⁰, JM109²¹, BL21 (DE3)²² und Rossetta2²³.

Ursprünglich wurden E. coli-Stämme mit reduzierten RNase- und Proteaseaktivitäten ausgewählt, um die mRNA-Stabilität und die Stabilität neu synthetisierter rekombinanter Proteine zu verbessern, was zu einer erhöhten Endproteinausbeute führte²⁴. Anschließend wurden E. coli-Extrakte entwickelt, um spezifische posttranslationale Modifikationen, einschließlich Glykosylierung²⁵, Phosphorylierung²⁶ und Lipidierung²⁷, zu erleichtern, um die oben genannten posttranslationalen Modifikationen zu erreichen. Darüber hinaus wurde eine Reihe von Additiven wie molekulare Chaperone²⁸ und chemische Stabilisatoren integriert, um die Faltung von Zielproteinen zu unterstützen und so zur Diversifizierung der CFPS-Systeme beizutragen. Die für ihre hohe Prozessivität bekannte Bakteriophagen-T7-RNA-Polymerase wird überwiegend für die Transkription eingesetzt, obwohl auch andere Polymerasen wie SP6²⁹ verwendet wurden. Die endogene RNA-Polymerase von E. coli wurde für das Prototyping genetischer Schaltkreise unter Nutzung der Sigma-Faktoren³⁰ angepasst. Schließlich wurden eine Vielzahl von Energievorläufern^{31, 32 und 33} sowie verschiedene Salze und Pufferkomponenten^{19, 34 und 35} systematisch optimiert, um die Produktivität zu steigern.

Neben dem CFPS-System selbst sind auch die Verkapselungsmethoden sowie die Kompartimentierungsmaterialien für den erfolgreichen Aufbau der synthetischen Zellen von entscheidender Bedeutung. Zu den verschiedenen Systemen, die entwickelt wurden, um die CFPS-Reaktion erfolgreich zu verkapseln, gehören tensidstabilisierte Wasser-/Öltröpfchen, Lipide/Polymere und ihre hybriden unilamellären Vesikel (mit Durchmessern von 50 nm bis zu mehreren μm) sowie planar gestützte Lipiddoppelschichten. Aufgrund des komplexierten Molekülgehalts des CFPS-Systems hängt die Erfolgsrate der Verkapselung jedoch von spezifischen Fällen ab, insbesondere bei der Bildung von Vesikel. Um die Erfolgsrate und Effizienz der Verkapselung von CFPS zu verbessern, wurden verschiedene Mikrofluid-Chips entwickelt, die die Bildung von Tröpfchen und Vesikeln erleichtern³⁶. Dennoch müssen weitere Chips und Geräte etabliert werden.

Dieses Protokoll beschreibt ein E. coli CFPS-System unter Verwendung des BL21(DE3)-Stammes, der ein häufig eingesetzter Wirt für die rekombinante Proteinproduktion ist. Das Protokoll umfasst eine detaillierte Darstellung der Zellextraktvorbereitung, der Template-Vorbereitung und der Standardexpressionsoptimierung unter Verwendung eines fluoreszierenden Reporterproteins. Darüber hinaus präsentieren wir beispielhafte Ergebnisse, die durch die Verkapselung des CFPS-Systems in verschiedenen Mikrokompartimenten erzielt wurden, einschließlich Monolayer-Tröpfchen, Doppelemulsionsvesikeln und Kammern, die sich auf gestützten Lipiddoppelschichten befinden. Schließlich erläutern wir die zentralen Verfahrenselemente und die erforderlichen Bedingungen, die für die erfolgreiche Einrichtung dieser GFPS-Systeme in unterschiedlichen Umweltkontexten unerlässlich sind.