Sentetik hücreler oluşturmak için hücresiz protein sentez sistemi
Summary
Bu protokol, sentetik hücrelerin yapımında kullanılan Hücresiz Protein Sentezi (CFPS) sistemini tanımlar. Farklı mikro bölmelerde temsili sonuçlarla temel aşamaları ana hatlarıyla belirtir. Protokol, sentetik hücre topluluğundaki çeşitli laboratuvarlar için en iyi uygulamaları oluşturmayı ve sentetik hücre gelişiminde ilerlemeyi ilerletmeyi amaçlamaktadır.
Abstract
Hücresiz Protein Sentezi (CFPS) sistemi, sentetik hücrelerin aşağıdan yukarıya montajını kolaylaştırmak için yaygın olarak kullanılmaktadır. Merkezi Dogma’nın çekirdek makineleri için ev sahibi olarak hizmet eder ve çeşitli yapay hücresel taklit sistemlerinin entegrasyonu ve montajı için en uygun şasi olarak durur. Sentetik hücrelerin imalatında sıklıkla kullanılmasına rağmen, belirli bir uygulama için özel ve sağlam bir CFPS sistemi kurmak önemsiz bir zorluk olmaya devam etmektedir. Bu yöntem belgesinde, sentetik hücrelerin yapımında rutin olarak kullanılan CFPS sistemi için kapsamlı bir protokol sunuyoruz. Bu protokol, hücre ekstraktı, şablon hazırlama ve bir floresan raportör proteini kullanan rutin ekspresyon optimizasyonu dahil olmak üzere CFPS sisteminin hazırlanmasındaki temel aşamaları kapsar. Ek olarak, CFPS sistemini tek katmanlı damlacıklar, çift emülsiyonlu veziküller ve desteklenen lipid çift katmanlarının üzerine yerleştirilmiş odalar gibi çeşitli mikro bölmeler içinde kapsülleyerek temsili sonuçlar gösteriyoruz. Son olarak, bu CFPS sistemlerinin farklı ortamlarda başarılı bir şekilde monte edilmesi için gerekli kritik adımları ve koşulları açıklıyoruz. Yaklaşımımızın, sürekli genişleyen sentetik hücre topluluğu içindeki çeşitli laboratuvarlar arasında iyi çalışma uygulamalarının oluşturulmasını kolaylaştırmasını ve böylece sentetik hücre geliştirme alanındaki ilerlemeyi hızlandırmasını bekliyoruz.
Introduction
Sentetik veya yapay hücrelerin sentezi, sentetik biyoloji, kimya ve biyofizik alanlarındaki bilim adamlarından büyük ilgi çeken, disiplinler arası araştırmaların oldukça belirgin bir alanı olarak ortaya çıkmıştır. Bu bilim adamları, minimal bir canlı hücre 1,2,3 inşa etme ortak hedefiyle birleşiyorlar. Bu alanın hızlı büyümesi, rekombinant DNA manipülasyonu4, biyomimetik malzemeler5 ve Hücresiz Protein Sentezi (CFPS) yöntemi 7 dahil olmak üzere bölümlendirme6 için mikrofabrikasyon teknikleri gibi kritik teknolojilerdeki önemli ilerlemelerle adım adım ilerlemiştir. CFPS sistemleri, çok işlevli yapay hücrelerin geliştirilmesi ve entegrasyonu için temel çerçeveyi sağlayarak, transkripsiyon ve translasyon için gerekli hücresel mekanizmayı kapsar.
CFPS teknikleri sentetik hücrelerin montajında sıklıkla kullanılsa da, çeşitli sentetik hücre sistemlerinin montajı için sağlam ve özel bir CFPS sistemi geliştirmek karmaşık bir zorluk olmaya devam etmektedir. Şu anda, hem prokaryotlardan hem de ökaryot model organizmalardantüretilen çok sayıda CFPS sistemi mevcuttur 8 ve her biri sentetik hücre sentezindeki belirli uygulamalar için uzmanlaşmıştır. Transkripsiyon ve translasyondaki merkezi rollerinin ötesinde, CFPS sistemleri ana bileşenlerinde ve ilgili hazırlık prosedürlerinde farklılık gösterir. Hücre ekstraktları, RNA polimerazları, şablon hazırlama yöntemleri ve tampon bileşimlerindeki farklılıkları içeren bu varyasyonlar, büyük ölçüde, sistemlerini maksimum protein verimi için yoğun bir şekilde optimize eden araştırma grupları tarafından izlenen farklı geliştirme yörüngelerinden kaynaklanmaktadır.
CFPS sisteminin çeşitli bileşenleri arasında, hücre ekstraktı, transkripsiyon ve translasyon için kritik bir enzimatik havuzdur ve bu nedenle CFPS performansının önemli bir belirleyicisidir9. Escherichia coli (E. coli) bazlı CFPS, en iyi anlaşılan prokaryotik organizma statüsü nedeniyle en yaygın kullanılan sistemdir. Ayrıca, Ueda’nın araştırma grubu tarafından PURE10 olarak bilinen, ayrı ayrı saflaştırılmış proteinler ve ribozomlardan oluşan, tamamen yeniden yapılandırılmış bir CFPS sistemi geliştirilmiştir ve bu, özellikle net bir arka plan gerektiren uygulamalar için uygundur. Günümüzde, E. coli bazlı CFPS sistemleri bile, özellikle ekstrac11 için kaynak suşları ve hazırlama yöntemleri 12,13, RNA polimeraz14,15, enerji kaynakları 16,17 ve tampon sistemleri 18,19 açısından çeşitlenmiştir. En sık kullanılan suşlar, genetiği değiştirilmiş muadillerinin yanı sıra A1920, JM10921, BL21 (DE3)22 ve Rossetta223 gibi K12 ve B suş türevlerini içerir.
Başlangıçta, mRNA stabilitesini ve yeni sentezlenen rekombinant proteinlerin stabilitesini arttırmak için azaltılmış RNaz ve proteaz aktivitelerine sahip E. coli suşları seçildi ve bu da nihai protein verimlerinin artmasına yol açtı24. Daha sonra, E. coli ekstraktları, yukarıdaki posttranslasyon modifikasyonlarını elde etmek için glikosilasyon25, fosforilasyon26 ve lipidasyon27 dahil olmak üzere spesifik translasyon sonrası modifikasyonları kolaylaştırmak için tasarlandı. Ek olarak, hedef proteinlerin katlanmasına yardımcı olmak için moleküler şaperonlar28 ve kimyasal stabilizatörler gibi bir dizi katkı maddesi dahil edilmiştir ve CFPS sistemlerinin çeşitlendirilmesine katkıda bulunmuştur. Yüksek işlemselliği ile bilinen bakteriyofaj T7 RNA polimeraz, SP629 gibi diğer polimerazlar da kullanılmış olmasına rağmen, ağırlıklı olarak transkripsiyon için kullanılır. E. coli endojen RNA polimeraz, sigma faktörleri30’dan yararlanan genetik devrelerin prototiplenmesi için uyarlanmıştır. Son olarak, üretkenliği artırmak için çeşitli enerji öncüleri 31,32,33 ve farklı tuzlar ve tampon bileşenleri 19,34,35 sistematik olarak optimize edilmiştir.
CFPS sisteminin kendisinin yanı sıra, kapsülleme yöntemleri ve bölümlendirme malzemeleri de başarılı sentetik hücre montajı için hayati önem taşır. CFPS reaksiyonunu başarılı bir şekilde kapsüllemek için geliştirilen çeşitli sistemler arasında yüzey aktif madde ile stabilize edilmiş su/yağ damlacıkları, lipit/polimer ve bunların hibrit unilamellar vezikülleri (çapları 50 nm ila birkaç μm arasında değişen) ve ayrıca düzlemsel destekli lipid çift katmanları bulunur. Bununla birlikte, CFPS sisteminin kompleks molekül içeriği nedeniyle, kapsüllemenin başarı oranı, özellikle vezikül oluşumu için belirli durumlara bağlıdır. CFPS’nin kapsüllenmesinin başarı oranını ve verimliliğini artırmak için, hem damlacıkların hem de veziküllerin oluşumunu kolaylaştırmak için çeşitli mikroakışkan çipleri geliştirilmiştir36. Bununla birlikte, ek çipler ve cihazların kurulması gerekecektir.
Bu protokol, rekombinant protein üretimi için yaygın olarak kullanılan bir konakçı olan BL21 (DE3) suşunu kullanan bir E. coli CFPS sistemini tanımlar. Protokol, bir floresan raportör proteini kullanılarak hücre ekstraktı hazırlığı, şablon hazırlama ve standart ekspresyon optimizasyonunun ayrıntılı bir hesabını kapsar. Ayrıca, CFPS sistemini tek katmanlı damlacıklar, çift emülsiyon vezikülleri ve desteklenen lipid çift katmanlarının üzerine yerleştirilmiş odalar dahil olmak üzere çeşitli mikro bölmeler içinde kapsülleyerek elde edilen örnek sonuçlar sunuyoruz. Son olarak, bu CFPS sistemlerinin farklı çevresel bağlamlarda başarılı bir şekilde kurulması için vazgeçilmez olan önemli prosedür unsurlarını ve gerekli koşulları açıklıyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu el yazması, yağda su damlacıkları, GUV’ler ve SLB’ler dahil olmak üzere sentetik hücre platformlarında çeşitli mikro bölmelerde kullanılmak üzere tasarlanmış modifiye edilmiş bir Hücresiz Protein Sentezi (CFPS) sistemini özetlemektedir. Protein merkezli sentetik hücre sistemleri oluşturmak için kaynak ekstrakt olarak standart E. coli rekombinant protein ekspresyon konak suşu, BL21 (DE3) kullandık. Bu yaklaşım, farklı bölmelerde yaklaşık 0.5 mg / mL…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
M. Y., Çin’in Jiangsu Eyaleti Lisansüstü Araştırma ve Uygulama İnovasyon Programından sağlanan finansmanı kabul eder (Hibe No. KYCX22_2803). LK, Çin, Çin Jiangsu Yüksek Öğretim Kurumları Doğa Bilimleri Araştırmaları (Hibe No. 17KJB180003), Çin Jiangsu Normal Üniversitesi Doğa Bilimleri Vakfı (Hibe No. 17XLR037), Jiangsu Yüksek Öğretim Kurumlarının Öncelikli Akademik Program Geliştirme, Çin ve Jiangsu Özel Olarak Atanmış Profesör programı, Çin.
Materials
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine(DOPC) | Avanti | 850375P | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt)(DOPS) | Avanti | 840035P | |
| 1,4 dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 1.11474 | |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) | Avanti | 850457P | |
| 3,5-cyclic AMP (cAMP) | Sigma-Aldrich | A9501 | |
| 50 mL tubes | Eppendorf | Eppendorf Tubes BioBased | |
| 50% hydrogen peroxide | Sigma-Aldrich | 516813 | |
| Acetate | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Agar powder | Sigma-Aldrich | 05040 | |
| Alanin | Sigma-Aldrich | A4349 | |
| Amicon Stirred Cells | MerckMillipore | UFSC05001 | |
| Ammonium acetate (NH4OAc) | Sigma-Aldrich | A7262 | |
| Arginin | Sigma-Aldrich | A4474 | |
| Asparagin | Sigma-Aldrich | A0884 | |
| Aspartat | Sigma-Aldrich | A5474 | |
| ATP | Roche | 11140965001 | |
| Atto 488 DOPE | Sigma-Aldrich | 67335 | |
| Atto 647N DOPE | Sigma-Aldrich | 42247 | |
| Baffled Erlenmeyer flask | Shuniu | 250 mL, 1000mL | |
| Bovine Serum Albumin(BSA) | Roche | 10711454001 | |
| Centrifugetube | Eppendorf | Eppendorf Tubes 3810X | |
| Centrifugetube rack | Eppendorf | 0030119819 | |
| Chemiluminescence and epifluorescence imaging system | Uvitec | Alliance Q9 Advanced | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 288306 | |
| Confocal Laser Scanning Microscopy (LSM) | ZEISS | LSM 780 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermo Fisher Scientific | C10283 | |
| Coverslip | Thermo Scientific | Menzel BB02400500A113MNZ0 | |
| creatine kinase (CK) | Roche | 10127566001 | |
| Creatine phosphate (CP) | Sigma-Aldrich | 10621714001 | |
| Culture dish | Huanqiu | 90 mm | |
| Cystein | Sigma-Aldrich | C5360 | |
| Cytidine 5'-triphosphate disodium salt (CTP) | aladdin | C101487 | |
| Dialysis membrane | Spectrum | Standard RC Tubing MWCO: 12-14 kD | |
| E.Z.N.A. Cycle Pure Kit | Omega Bio-Tek | D6492-01 | |
| Electro-Heating Standing-Temperature Cultivator | Yiheng instrument | DHP-9602 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid(EDTA) | Biosharp | 1100027 | |
| Fluorescent plate reader | BioTek | Synergy 2 | |
| Fluorinated oil | Suzhou CChip scientific instrument | 2%HFE7500 | |
| Folinic acid | Sigma-Aldrich | 47612 | |
| French Press | G.Heinemann | HTU-DIGI-Press | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| Glutamat | Sigma-Aldrich | G5667 | |
| Glutamin | Sigma-Aldrich | G5792 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Glycin | Sigma-Aldrich | G7126 | |
| Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate(GTP) | Roche | 10106399001 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| HiPrep Q FF 16/10 | Cytiva | 28936543 | |
| Histidin | Sigma-Aldrich | H6034 | |
| Isoleucin | Sigma-Aldrich | I5281 | |
| Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sigma-Aldrich | I5502 | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P8281 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Leucin | Sigma-Aldrich | L6914 | |
| Lysin | Sigma-Aldrich | L5501 | |
| Magnesium acetate tetrahydrate (Mg(OAc)2 ) | Sigma-Aldrich | M5661 | |
| Magnesium chloride(MgCl2) | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Methionin | Sigma-Aldrich | M8439 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 R | |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M5904 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell Systems | Bio-Rad | 1645050 | |
| Multipurpose Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| NaN3 | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Nucleic Acid & Protein UV-Assay Measurements | IMPLEN | NanoPhotometer N60 | |
| NucleoBond Xtra Maxi kit for transfection-grade plasmid DNA | MACHEREY-NAGEL | 740414.5 | |
| Nunc-Immuno MicroWell 96 well polystyrene plates | Sigma-Aldrich | P8616 | |
| PCR Thermal Cycler | Eppendorf | Mastercycler nexus | |
| Peptone | Sigma-Aldrich | 83059 | |
| Phenylalanin | Sigma-Aldrich | P8740 | |
| Phosphoenolpyruvat (PEP) | GLPBIO | GC44635 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | PMSF-RO | |
| Polyethylene glycol 8000 (PEG 8000) | Sigma-Aldrich | 89510 | |
| Potassium Acetate(KOAc) | Sigma-Aldrich | P5708 | |
| Potassium chloride(KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Potassium glutamate (K-glutamate) | Sigma-Aldrich | G1501 | |
| Potassium hydroxide(KOH) | Sigma-Aldrich | 221473 | |
| Prolin | Sigma-Aldrich | P8865 | |
| Pyruvate kinase (PK) | Sigma-Aldrich | P9136 | |
| Serin | Sigma-Aldrich | S4311 | |
| Shaker | Zhichushakers | ZQZY-AF8 | |
| Sodium chloride(NaCl) | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Sodium hydroxide(NaOH) | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Sucrose | aladdin | S112226 | |
| Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 339741 | |
| Syringe Filters | Jinteng | 0.45 μm | |
| Test tube | Shuniu | 20 mL | |
| TGX FastCast Acrylamide Kit, 12% | Bio-Rad | #1610175 | |
| ThermoMixer | Eppendorf | ThermoMixer C | |
| Threonin | Sigma-Aldrich | T8441 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | V900483 | |
| tRNA | Roche | 10109550001 | |
| Tryptone | Sigma-Aldrich | T7293 | |
| Tryptophan | Sigma-Aldrich | T8941 | |
| Tyrosin | Sigma-Aldrich | T8566 | |
| UTP Trisodium salt (UTP) | aladdin | U100365 | |
| Vacuum Pump with Circulated Water System | Zhengzhou Greatwall Scientific Industrial and Trade Co.Ltd | SHB- |
|
| Valin | Sigma-Aldrich | V4638 | |
| Vortex Mixers | Kylin-Bell | Vortex QL-861 | |
| Water purification system | MerckMillipore | Direct ultrapure water (Type 1) | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | 70161 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | 444203 |
References
- Elani, Y. Interfacing living and synthetic cells as an emerging frontier in synthetic biology. Angew Chem Int Ed Engl. 60 (11), 5602-5611 (2021).
- Cho, E., Lu, Y. Compartmentalizing cell-free systems: toward creating life-like artificial cells and beyond. ACS Synth Biol. 9 (11), 2881-2901 (2020).
- Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications. Nat Rev Genet. 21 (3), 151-170 (2020).
- Zhang, L., Guo, W., Lu, Y. Advances in cell-free biosensors: principle, mechanism, and applications. Biotechnol J. 15 (9), e2000187 (2020).
- Lu, Y., Allegri, G., Huskens, J. Vesicle-based artificial cells: materials, construction methods and applications. Mater Horiz. 9 (3), 892-907 (2022).
- Fu, Z., Ochsner, M. A., De Hoog, H. P., Tomczak, N., Nallani, M. Multicompartmentalized polymersomes for selective encapsulation of biomacromolecules. Chem Commun (Camb). 47 (10), 2862-2864 (2011).
- Ayoubi-Joshaghani, M. H., et al. Cell-free protein synthesis: the transition from batch reactions to minimal cells and microfluidic devices. Biotechnol Bioeng. 117 (4), 1204-1229 (2020).
- Yue, K., Chen, J. Y., Li, Y. Q., Kai, L. Advancing synthetic biology through cell-free protein synthesis. Comput Struct Biotechnol J. 21, 2899-2908 (2023).
- Kwon, Y. C., Jewett, M. C. High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis. Sci Rep. 5, 8663 (2015).
- Shimizu, Y., et al. Cell-free translation reconstituted with purified components. Nat Biotechnol. 19 (8), 751-755 (2001).
- Schwarz, D., et al. Preparative scale expression of membrane proteins in Escherichia coli-based continuous exchange cell-free systems. Nat Protoc. 2 (11), 2945-2957 (2007).
- Levine, M. Z., Gregorio, N. E., Jewett, M. C., Watts, K. R., Oza, J. P. Escherichia coli-based cell-free protein synthesis: protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology. J Vis Exp. (144), e58882 (2019).
- Cole, S. D., Miklos, A. E., Chiao, A. C., Sun, Z. Z., Lux, M. W. Methodologies for preparation of prokaryotic extracts for cell-free expression systems. Synth Syst Biotechnol. 5 (4), 252-267 (2020).
- Shin, J., Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous E. coli RNA polymerase and sigma factor 70. J Biol Eng. 4, 8 (2010).
- Mcmanus, J. B., Emanuel, P. A., Murray, R. M., Lux, M. W. A method for cost-effective and rapid characterization of engineered T7-based transcription factors by cell-free protein synthesis reveals insights into the regulation of T7 RNA polymerase-driven expression. Arch Biochem Biophys. 674, 108045 (2019).
- Kim, T. W., et al. Prolonged cell-free protein synthesis using dual energy sources: combined use of creatine phosphate and glucose for the efficient supply of ATP and retarded accumulation of phosphate. Biotechnol Bioeng. 97 (6), 1510-1515 (2007).
- Kim, D. M., Swartz, J. R. Regeneration of adenosine triphosphate from glycolytic intermediates for cell-free protein synthesis. Biotechnol Bioeng. 74 (4), 309-316 (2001).
- Liu, Y., Fritz, B. R., Anderson, M. J., Schoborg, J. A., Jewett, M. C. Characterizing and alleviating substrate limitations for improved in vitro ribosome construction. ACS Synth Biol. 4 (4), 454-462 (2015).
- Rasor, B. J., et al. Mechanistic insights into cell-free gene expression through an integrated-omics analysis of extract processing methods. ACS Synth Biol. 12 (2), 405-418 (2023).
- Kim, D. M., Kigawa, T., Choi, C. Y., Yokoyama, S. A highly efficient cell-free protein synthesis system from Escherichia coli. Eur J Biochem. 239 (3), 881-886 (1996).
- Li, J. J., Li, P. X., Liu, Q., Li, J. J., Qi, H. Translation initiation consistency between in vivo and in vitro bacterial protein expression systems. Front Bioeng Biotechnol. 11, 1201580 (2023).
- Shrestha, P., Holland, T. M., Bundy, B. C. Streamlined extract preparation for Escherichia coli-based cell-free protein synthesis by sonication or bead vortex mixing. Biotechniques. 53 (3), 163-174 (2012).
- Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based tx-tl cell-free expression system for synthetic biology. J Vis Exp. (79), e50762 (2013).
- Zubay, G. In vitro synthesis of protein in microbial systems. Annu Rev Genet. 7, 267-287 (1973).
- Jaroentomeechai, T., et al. Single-pot glycoprotein biosynthesis using a cell-free transcription-translation system enriched with glycosylation machinery. Nat Commun. 9 (1), 2686 (2018).
- Katsura, K., et al. Phosphorylated and non-phosphorylated HCK kinase domains produced by cell-free protein expression. Protein Expr Purif. 150, 92-99 (2018).
- Suzuki, T., et al. N-terminal protein modifications in an insect cell-free protein synthesis system and their identification by mass spectrometry. Proteomics. 6 (16), 4486-4495 (2006).
- Chi, H., Wang, X., Li, J., Ren, H., Huang, F. Chaperonin-enhanced Escherichia coli cell-free expression of functional CXCR4. J Biotechnol. 231, 193-200 (2016).
- Endo, Y., Sawasaki, T. High-throughput, genome-scale protein production method based on the wheat germ cell-free expression system. Biotechnol Adv. 21 (8), 695-713 (2003).
- Shin, J., Noireaux, V. An E. coli cell-free expression toolbox: Application to synthetic gene circuits and artificial cells. ACS Synth Biol. 1 (1), 29-41 (2012).
- Jewett, M. C., Swartz, J. R. Mimicking the Escherichia coli cytoplasmic environment activates long-lived and efficient cell-free protein synthesis. Biotechnol Bioeng. 86 (1), 19-26 (2004).
- Ryabova, L. A., Vinokurov, L. M., Shekhovtsova, E. A., Alakhov, Y. B., Spirin, A. S. Acetyl phosphate as an energy source for bacterial cell-free translation systems. Anal Biochem. 226 (1), 184-186 (1995).
- Guzman-Chavez, F., et al. Constructing cell-free expression systems for low-cost access. ACS Synth Biol. 11 (3), 1114-1128 (2022).
- Jewett, M. C., Swartz, J. R. Substrate replenishment extends protein synthesis with an in vitro translation system designed to mimic the cytoplasm. Biotechnol Bioeng. 87 (4), 465-472 (2004).
- Caschera, F., et al. High-throughput optimization cycle of a cell-free ribosome assembly and protein synthesis system. ACS Synth Biol. 7 (12), 2841-2853 (2018).
- Yue, K., et al. Bottom-up synthetic biology using cell-free protein synthesis. Adv Biochem Eng Biotechnol. 185, 1-20 (2023).
- Liu, D. V., Zawada, J. F., Swartz, J. R. Streamlining Escherichia coli S30 extract preparation for economical cell-free protein synthesis. Biotechnol Prog. 21 (2), 460-465 (2005).
- Kim, T. W., et al. Simple procedures for the construction of a robust and cost-effective cell-free protein synthesis system. J Biotechnol. 126 (4), 554-561 (2006).
- McPhie, P. [4] Dialysis. Methods Enzymol. 22, 23-32 (1971).
- Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J Vis Exp. (6), e253 (2007).
- Kai, L., et al. Systems for the cell-free synthesis of proteins. Methods Mol Biol. 800, 201-225 (2012).
- Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. J Extracell Vesicles. 4, 27031 (2015).
- Hori, Y., Kantak, C., Murray, R. M., Abate, A. R. Cell-free extract based optimization of biomolecular circuits with droplet microfluidics. Lab Chip. 17 (18), 3037-3042 (2017).
- Takahashi, H., Ogawa, A. Preparation of a millimeter-sized supergiant liposome that allows for efficient, eukaryotic cell-free translation in the interior by spontaneous emulsion transfer. ACS Synth Biol. 9 (7), 1608-1614 (2020).
- Adir, O., et al. Preparing protein producing synthetic cells using cell free bacterial extracts, liposomes and emulsion transfer. J Vis Exp. (158), e60829 (2020).
- Kai, L., Dotsch, V., Kaldenhoff, R., Bernhard, F. Artificial environments for the co-translational stabilization of cell-free expressed proteins. PLoS One. 8 (2), e56637 (2013).
- Kai, L., Sonal, H. T., Schwille, P. Reconstitution of a reversible membrane switch via prenylation by one-pot cell-free expression. ACS Synth Biol. 12 (1), 108-119 (2023).
- Foshag, D., et al. The E. Coli S30 lysate proteome: a prototype for cell-free protein production. N Biotechnol. 40, 245-260 (2018).
- Garenne, D., Beisel, C. L., Noireaux, V. Characterization of the all-E. coli transcription-translation system mytxtl by mass spectrometry. Rapid Commun Mass Spectrom. 33 (11), 1036-1048 (2019).
- Puigbo, P., Guzman, E., Romeu, A., Garcia-Vallve, S. Optimizer: A web server for optimizing the codon usage of DNA sequences. Nucleic Acids Res. 35, W126-W131 (2007).
- Wiegand, D. J., Lee, H. H., Ostrov, N., Church, G. M. Cell-free protein expression using the rapidly growing bacterium vibrio natriegens. J Vis Exp. (145), e59495 (2019).
- Calhoun, K. A., Swartz, J. R. An economical method for cell-free protein synthesis using glucose and nucleoside monophosphates. Biotechnol Prog. 21 (4), 1146-1153 (2005).
- Kim, D. M., Swartz, J. R. Prolonging cell-free protein synthesis with a novel ATP regeneration system. Biotechnol Bioeng. 66 (3), 180-188 (1999).
- Nishimura, K., et al. Cell-free protein synthesis inside giant unilamellar vesicles analyzed by flow cytometry. Langmuir. 28 (22), 8426-8432 (2012).
- Teh, S. Y., Khnouf, R., Fan, H., Lee, A. P. Stable, biocompatible lipid vesicle generation by solvent extraction-based droplet microfluidics. Biomicrofluidics. 5 (4), 044113 (2011).
