Sistema di sintesi proteica cell-free per la costruzione di cellule sintetiche

La sintesi di cellule sintetiche o artificiali è emersa come un campo di ricerca interdisciplinare molto importante, attirando un notevole interesse da parte di scienziati nei settori della biologia sintetica, della chimica e della biofisica. Questi scienziati sono uniti dall’obiettivo comune di costruire una cellula vivente minima ^1,2,3. La rapida crescita di questo campo è andata di pari passo con i progressi significativi nelle tecnologie critiche, come la manipolazione del DNA ricombinante⁴, i materiali biomimetici⁵ e le tecniche di microfabbricazione per la compartimentazione⁶, incluso il metodo di sintesi proteica libera da cellule (CFPS)⁷. I sistemi CFPS comprendono il macchinario cellulare essenziale per la trascrizione e la traduzione, fornendo il quadro di base per lo sviluppo e l’integrazione di cellule artificiali multifunzionali.

Sebbene le tecniche CFPS siano spesso utilizzate nell’assemblaggio di celle sintetiche, lo sviluppo di un sistema CFPS robusto e su misura per l’assemblaggio di vari sistemi di celle sintetiche rimane una sfida complessa. Attualmente, sono disponibili numerosi sistemi CFPS, derivati sia da organismi modello di procarioti che di eucarioti⁸, ciascuno specializzato per particolari applicazioni nella sintesi cellulare sintetica. Oltre al loro ruolo centrale nella trascrizione e nella traduzione, i sistemi CFPS variano nei loro componenti principali e nelle procedure di preparazione associate. Queste variazioni, che includono differenze negli estratti cellulari, nelle RNA polimerasi, nei metodi di preparazione dei modelli e nelle composizioni dei tamponi, sono in gran parte dovute alle distinte traiettorie di sviluppo perseguite dai gruppi di ricerca che hanno ottimizzato intensamente i loro sistemi per la massima resa proteica.

Tra i vari componenti del sistema CFPS, l’estratto cellulare è un pool enzimatico critico per la trascrizione e la traduzione, e quindi un determinante chiave delle prestazioni della CFPS⁹. La CFPS a base di Escherichia coli (E. coli) è il sistema più comunemente utilizzato grazie al suo status di organismo procariotico meglio conosciuto. Inoltre, il gruppo di ricerca di Ueda ha sviluppato un sistema CFPS completamente ricostituito che comprende proteine e ribosomi purificati individualmente, noto come PURE¹⁰, particolarmente adatto per applicazioni che richiedono un background chiaro. Oggi, anche i sistemi CFPS basati su E. coli si sono diversificati, soprattutto in termini di ceppi sorgente per l’extrac¹¹ e i metodi di preparazione^12,13, RNA polimerasi^14,15, fonti di energia^16,17 e sistemi tampone^18,19. I ceppi più frequentemente utilizzati includono i derivati dei ceppi K12 e B, come A19²⁰, JM109²¹, BL21 (DE3)²² e Rossetta2²³, insieme alle loro controparti geneticamente modificate.

Inizialmente, sono stati scelti ceppi di E. coli con ridotte attività di RNasi e proteasi per migliorare la stabilità dell’mRNA e la stabilità delle proteine ricombinanti di nuova sintesi, portando a un aumento delle rese proteiche finali²⁴. Successivamente, gli estratti di E. coli sono stati ingegnerizzati per facilitare specifiche modifiche post-traduzionali, tra cui la glicosilazione²⁵, la fosforilazione²⁶ e la lipidazione²⁷, sono stati sviluppati per ottenere le modifiche post-traduzionali di cui sopra. Inoltre, è stata incorporata una serie di additivi come chaperon molecolari²⁸ e stabilizzanti chimici per aiutare il ripiegamento delle proteine bersaglio, contribuendo alla diversificazione dei sistemi CFPS. La batteriofago T7 RNA polimerasi, nota per la sua elevata processività, è prevalentemente impiegata per la trascrizione, sebbene siano state utilizzate anche altre polimerasi come SP6²⁹. L’RNA polimerasi endogena di E. coli è stata adattata per la prototipazione di circuiti genetici sfruttando i fattori sigma³⁰. Infine, una varietà di precursori energetici 31,32,33 e diversi sali e componenti tampone 19,34,35 sono stati sistematicamente ottimizzati per migliorare la produttività.

Oltre al sistema CFPS stesso, anche i metodi di incapsulamento e i materiali di compartimentazione sono vitali per il successo dell’assemblaggio di celle sintetiche. Vari sistemi che sono stati sviluppati per incapsulare con successo la reazione CFPS includono goccioline di acqua/olio stabilizzate con tensioattivo, lipidi/polimero e le loro vescicole unilamellari ibride (con diametri che vanno da 50 nm a diversi μm), nonché doppi strati lipidici supportati da planari. Tuttavia, a causa del contenuto di molecole complessate del sistema CFPS, il tasso di successo dell’incapsulamento dipende da casi specifici, in particolare per la formazione di vescicole. Per migliorare il tasso di successo e l’efficienza dell’incapsulamento della CFPS, sono stati sviluppati vari chip di microfluidi per facilitare la formazione di goccioline e vescicole³⁶. Tuttavia, sarà necessario stabilire chip e dispositivi aggiuntivi.

Questo protocollo delinea un sistema CFPS di E. coli che utilizza il ceppo BL21(DE3), che è un ospite comunemente impiegato per la produzione di proteine ricombinanti. Il protocollo comprende un resoconto dettagliato della preparazione dell’estratto cellulare, della preparazione del modello e dell’ottimizzazione dell’espressione standard utilizzando una proteina reporter fluorescente. Inoltre, presentiamo risultati esemplari ottenuti incapsulando il sistema CFPS all’interno di diversi micro-compartimenti, tra cui goccioline monostrato, vescicole a doppia emulsione e camere situate sopra doppi strati lipidici supportati. Infine, vengono illustrati gli elementi procedurali fondamentali e le condizioni necessarie per il successo dell’istituzione di questi sistemi di PCPS in contesti ambientali distinti.