Celvrij eiwitsynthesesysteem voor het bouwen van synthetische cellen

De synthese van synthetische of kunstmatige cellen is naar voren gekomen als een zeer prominent gebied van interdisciplinair onderzoek, dat aanzienlijke belangstelling trekt van wetenschappers in de domeinen van synthetische biologie, scheikunde en biofysica. Deze wetenschappers zijn verenigd door het gemeenschappelijke doel om een minimale levende cel te bouwen ^1,2,3. De snelle groei van dit vakgebied is in lijn met aanzienlijke vooruitgang in kritieke technologieën, zoals recombinant-DNA-manipulatie⁴, biomimetische materialen⁵ en microfabricagetechnieken voor compartimentering⁶, waaronder de Cell-Free Protein Synthesis (CFPS) -methode⁷. CFPS-systemen omvatten de essentiële cellulaire machinerie voor transcriptie en vertaling en bieden het fundamentele kader voor de ontwikkeling en integratie van multifunctionele kunstmatige cellen.

Hoewel CFPS-technieken vaak worden gebruikt bij de assemblage van synthetische cellen, blijft het ontwikkelen van een robuust en op maat gemaakt CFPS-systeem voor de assemblage van verschillende synthetische celsystemen een complexe uitdaging. Momenteel zijn er tal van CFPS-systemen beschikbaar, afgeleid van zowel prokaryoten als eukaryoten modelorganismen⁸, elk gespecialiseerd voor specifieke toepassingen in synthetische celsynthese. Naast hun centrale rol bij transcriptie en vertaling, variëren CFPS-systemen in hun belangrijkste componenten en bijbehorende voorbereidingsprocedures. Deze variaties, waaronder verschillen in celextracten, RNA-polymerasen, sjabloonbereidingsmethoden en buffersamenstellingen, zijn grotendeels te wijten aan de verschillende ontwikkelingstrajecten die worden gevolgd door onderzoeksgroepen die hun systemen intensief hebben geoptimaliseerd voor maximale eiwitopbrengst.

Van de verschillende componenten van het CFPS-systeem is het celextract een kritische enzymatische pool voor transcriptie en translatie, en dus een belangrijke bepalende factor voor^{de prestaties van} CFPS. Op Escherichia coli (E. coli) gebaseerde CFPS is het meest gebruikte systeem vanwege zijn status als het best begrepen prokaryote organisme. Bovendien heeft de onderzoeksgroep van Ueda een volledig gereconstitueerd CFPS-systeem ontwikkeld dat bestaat uit individueel gezuiverde eiwitten en ribosomen, bekend als PURE¹⁰, dat bijzonder geschikt is voor toepassingen die een heldere achtergrond vereisen. Tegenwoordig zijn zelfs op E. coli gebaseerde CFPS-systemen gediversifieerd, vooral wat betreft de bronstammen voor de extrac¹¹ en bereidingsmethoden^12,13, RNA-polymerase^14,15, energiebronnen^16,17 en buffersystemen^18,19. De meest gebruikte stammen zijn afgeleiden van de K12- en B-stam, zoals A19²⁰, JM109²¹, BL21 (DE3)²² en Rossetta2²³, naast hun genetisch gemodificeerde tegenhangers.

Aanvankelijk werden E. coli-stammen met verminderde RNase- en protease-activiteiten gekozen om de mRNA-stabiliteit en de stabiliteit van nieuw gesynthetiseerde recombinante eiwitten te verbeteren, wat leidde tot verhoogde uiteindelijke eiwitopbrengsten²⁴. Vervolgens werden E. coli-extracten ontwikkeld om specifieke posttranslationele modificaties mogelijk te maken, waaronder glycosylering²⁵, fosforylering²⁶ en lipidatie²⁷, om de bovenstaande posttranslationele modificaties te bereiken. Bovendien is een reeks additieven zoals moleculaire chaperons²⁸ en chemische stabilisatoren opgenomen om de vouwing van doeleiwitten te vergemakkelijken, wat bijdraagt aan de diversificatie van CFPS-systemen. De bacteriofaag T7 RNA-polymerase, bekend om zijn hoge processiviteit, wordt voornamelijk gebruikt voor transcriptie, hoewel andere polymerasen zoals SP6²⁹ ook zijn gebruikt. E. coli endogene RNA-polymerase is aangepast voor de prototyping van genetische circuits met behulp van sigmafactoren³⁰. Ten slotte zijn een verscheidenheid aan energieprecursoren 31,32,33 en verschillende zouten en buffercomponenten 19,34,35 systematisch geoptimaliseerd om de productiviteit te verhogen.

Naast het CFPS-systeem zelf zijn ook de inkapselingsmethoden en compartimenteringsmaterialen van vitaal belang voor de succesvolle assemblage van synthetische cellen. Verschillende systemen die zijn ontwikkeld om de CFPS-reactie met succes in te kapselen, zijn onder meer met oppervlakteactieve stoffen gestabiliseerde water-/oliedruppels, lipiden/polymeren en hun hybride unilamellaire blaasjes (met diameters variërend van 50 nm tot enkele μm), evenals vlak ondersteunde lipidedubbellagen. Vanwege de gecomplexeerde molecuulinhoud van het CFPS-systeem hangt het slagingspercentage van inkapseling echter af van specifieke gevallen, met name voor de vorming van blaasjes. Om het slagingspercentage en de efficiëntie van de inkapseling van CFFS te verbeteren, zijn er verschillende microvloeistofchips ontwikkeld om de vorming van zowel druppeltjes als blaasjes te vergemakkelijken³⁶. Desalniettemin zullen er extra chips en apparaten moeten worden vastgesteld.

Dit protocol schetst een E. coli CFPS-systeem dat gebruik maakt van de BL21(DE3)-stam, een veelgebruikte gastheer voor de productie van recombinante eiwitten. Het protocol omvat een gedetailleerd verslag van de bereiding van het celextract, de sjabloonbereiding en de optimalisatie van standaardexpressie met behulp van een fluorescerend reporter-eiwit. Bovendien presenteren we voorbeeldige resultaten die zijn bereikt door het CFPS-systeem in te kapselen in diverse microcompartimenten, waaronder monolaagdruppels, dubbele emulsieblaasjes en kamers bovenop ondersteunde lipidedubbellagen. Ten slotte gaan we in op de cruciale procedurele elementen en de vereiste voorwaarden die onmisbaar zijn voor de succesvolle invoering van deze CFPS-systemen binnen verschillende milieucontexten.