SYSTÈME DE SYNTHÈSE DE PROTÉINES ACELLULAIRES POUR LA CONSTRUCTION DE CELLULES SYNTHÉTIQUES

La synthèse de cellules synthétiques ou artificielles est devenue un domaine de recherche interdisciplinaire très important, suscitant un intérêt considérable de la part des scientifiques dans les domaines de la biologie synthétique, de la chimie et de la biophysique. Ces scientifiques sont unis par l’objectif commun de construire une cellule vivante minimale ^1,2,3. La croissance rapide de ce domaine a été en phase avec des avancées significatives dans des technologies critiques, telles que la manipulation de l’ADN recombinant⁴, les matériaux biomimétiques⁵ et les techniques de microfabrication pour la compartimentation⁶, y compris la méthode de synthèse de protéines libres (CFPS)⁷. Les systèmes CFPS englobent la machinerie cellulaire essentielle à la transcription et à la traduction, fournissant le cadre fondamental pour le développement et l’intégration de cellules artificielles multifonctionnelles.

Bien que les techniques CFPS soient fréquemment utilisées dans l’assemblage de cellules synthétiques, le développement d’un système CFPS robuste et adapté à l’assemblage de divers systèmes de cellules synthétiques reste un défi complexe. À l’heure actuelle, il existe de nombreux systèmes CFPS, dérivés à la fois de procaryotes et d’organismes modèles eucaryotes⁸, chacun spécialisé pour des applications particulières dans la synthèse cellulaire synthétique. Au-delà de leur rôle central dans la transcription et la traduction, les systèmes CFPS varient dans leurs principaux composants et les procédures de préparation associées. Ces variations, qui incluent des différences dans les extraits cellulaires, les ARN polymérases, les méthodes de préparation des matrices et les compositions tampons, sont en grande partie dues aux trajectoires de développement distinctes poursuivies par les groupes de recherche qui ont intensivement optimisé leurs systèmes pour un rendement maximal en protéines.

Parmi les différents composants du système CFPS, l’extrait cellulaire est un pool enzymatique critique pour la transcription et la traduction, et donc un déterminant clé de la performance CFPS⁹. Le CFPS basé sur Escherichia coli (E. coli) est le système le plus couramment utilisé en raison de son statut d’organisme procaryote le mieux compris. De plus, un système CFPS entièrement reconstitué comprenant des protéines et des ribosomes purifiés individuellement, connu sous le nom de PURE¹⁰, a été développé par le groupe de recherche d’Ueda, qui est particulièrement adapté aux applications nécessitant un arrière-plan clair. Aujourd’hui, même les systèmes CFPS à base d’E. coli se sont diversifiés, notamment en termes de souches sources pour l’extrac¹¹ et de méthodes de préparation^12,13, d’ARN polymérase^14,15, de sources d’énergie^16,17 et de systèmes tampons^18,19. Les souches les plus fréquemment utilisées comprennent les dérivés des souches K12 et B, tels que A19²⁰, JM109²¹, BL21 (DE3)²² et Rossetta2²³, ainsi que leurs homologues génétiquement modifiés.

Initialement, les souches d’E. coli avec des activités RNases et protéases réduites ont été choisies pour améliorer la stabilité de l’ARNm et la stabilité des protéines recombinantes nouvellement synthétisées, conduisant à une augmentation des rendements finaux en protéines²⁴. Par la suite, des extraits d’E. coli ont été modifiés pour faciliter des modifications post-traductionnelles spécifiques, notamment la glycosylation²⁵, la phosphorylation²⁶ et la lipidation²⁷, ont été développés pour réaliser les modifications post-traductionnelles ci-dessus. De plus, une gamme d’additifs tels que des chaperons^{moléculaires 28} et des stabilisants chimiques ont été incorporés pour faciliter le repliement des protéines cibles, contribuant ainsi à la diversification des systèmes CFPS. L’ARN polymérase T7 du bactériophage, connu pour sa processivité élevée, est principalement utilisé pour la transcription, bien que d’autres polymérases telles que SP6²⁹ aient également été utilisées. L’ARN polymérase endogène d’E. coli a été adaptée pour le prototypage de circuits génétiques en exploitant les facteurs sigma³⁰. Enfin, une variété de précurseurs d’énergie 31,32,33 et différents sels et composants tampons 19,34,35 ont été systématiquement optimisés pour améliorer la productivité.

Outre le système CFPS lui-même, les méthodes d’encapsulation ainsi que les matériaux de compartimentation sont également essentiels pour la réussite de l’assemblage des cellules synthétiques. Divers systèmes qui ont été développés pour encapsuler avec succès la réaction CFPS comprennent des gouttelettes d’eau/d’huile stabilisées par des tensioactifs, des lipides/polymères et leurs vésicules unilamellaires hybrides (avec des diamètres allant de 50 nm à plusieurs μm), ainsi que des bicouches lipidiques à support planaire. Cependant, en raison de la teneur en molécules complexées du système CFPS, le taux de réussite de l’encapsulation dépend de cas spécifiques, notamment pour la formation de vésicules. Pour améliorer le taux de réussite et l’efficacité de l’encapsulation des CFPS, diverses puces de microfluides ont été développées pour faciliter la formation de gouttelettes et de vésicules³⁶. Néanmoins, des puces et des appareils supplémentaires devront être mis en place.

Ce protocole délimite un système CFPS d’E. coli utilisant la souche BL21(DE3), qui est un hôte couramment utilisé pour la production de protéines recombinantes. Le protocole comprend un compte rendu détaillé de la préparation de l’extrait cellulaire, de la préparation de la matrice et de l’optimisation de l’expression standard à l’aide d’une protéine rapporteure fluorescente. De plus, nous présentons des résultats exemplaires obtenus en encapsulant le système CFPS dans divers micro-compartiments, y compris des gouttelettes monocouches, des vésicules à double émulsion et des chambres situées au sommet de bicouches lipidiques soutenues. Enfin, nous exposons les éléments procéduraux essentiels et les conditions requises indispensables à la mise en place réussie de ces systèmes CFPS dans des contextes environnementaux distincts.