מערכת סינתזת חלבונים ללא תאים לבניית תאים סינתטיים

הסינתזה של תאים סינתטיים או מלאכותיים התפתחה כתחום בולט ביותר של מחקר בין-תחומי, ומשכה עניין רב מצד מדענים בתחומי הביולוגיה הסינתטית, הכימיה והביופיזיקה. מדענים אלה מאוחדים על ידי המטרה המשותפת של בניית תא חי מינימלי ^1,2,3. הצמיחה המהירה של תחום זה באה במקביל להתקדמות משמעותית בטכנולוגיות קריטיות, כגון מניפולציה רקומביננטית של דנ”א⁴, חומרים ביומימטיים⁵, וטכניקות מיקרו-פבריקציה למידור⁶, כולל שיטת סינתזת חלבונים ללא תאים (CFPS)⁷. מערכות CFPS מקיפות את המנגנון התאי החיוני לשעתוק ותרגום, ומספקות את המסגרת הבסיסית לפיתוח ואינטגרציה של תאים מלאכותיים רב-תכליתיים.

למרות שטכניקות CFPS משמשות לעתים קרובות בהרכבה של תאים סינתטיים, פיתוח מערכת CFPS חזקה ומותאמת אישית להרכבה של מערכות תאים סינתטיים שונות נותר אתגר מורכב. נכון לעכשיו, קיימות מערכות CFPS רבות, הנגזרות הן מאורגניזמי מודל פרוקריוטים והן מאוקריוטים⁸, שכל אחד מהם מתמחה ביישומים מסוימים בסינתזה של תאים סינתטיים. מעבר לתפקידיהן המרכזיים בתמלול ובתרגום, מערכות CFPS נבדלות זו מזו במרכיביהן העיקריים ובהליכי ההכנה הקשורים אליהן. שינויים אלה, הכוללים הבדלים בתמציות תאים, RNA פולימראזות, שיטות הכנת תבניות והרכבי חיץ, נובעות במידה רבה ממסלולי הפיתוח הייחודיים של קבוצות מחקר שביצעו אופטימיזציה אינטנסיבית של המערכות שלהן לתפוקת חלבון מרבית.

בין המרכיבים השונים של מערכת CFPS, תמצית התא היא מאגר אנזימטי קריטי לשעתוק ותרגום, ולכן גורם מפתח בביצועי CFPS⁹. CFPS מבוסס Escherichia coli (E. coli) הוא המערכת הנפוצה ביותר בשל מעמדו כאורגניזם הפרוקריוטי המובן ביותר. יתר על כן, מערכת CFPS משוחזרת במלואה הכוללת חלבונים וריבוזומים מטוהרים בנפרד, המכונה PURE¹⁰, פותחה על ידי קבוצת המחקר של Ueda, המתאימה במיוחד ליישומים הדורשים רקע ברור. כיום, אפילו מערכות CFPS מבוססות E. coli התגוונו, במיוחד במונחים של זני המקור עבור extrac¹¹ ושיטות הכנה^12,13, RNA פולימראז^14,15, מקורות אנרגיה^16,17, ומערכות חיץ^18,19. הזנים הנפוצים ביותר כוללים נגזרות של זני K12 ו-B, כגון A19²⁰, JM109²¹, BL21 (DE3)²² ו-Rossetta2²³, לצד מקביליהם המהונדסים גנטית.

בתחילה, זני E. coli עם פעילויות RNase ופרוטאז מופחתות נבחרו כדי לשפר את יציבות mRNA ואת היציבות של חלבונים רקומביננטיים מסונתזים חדשים, מה שהוביל להגדלת תפוקת החלבון הסופי²⁴. לאחר מכן, תמציות E. coli הונדסו כדי להקל על שינויים ספציפיים לאחר תרגום, כולל גליקוזילציה²⁵, זרחן²⁶, ושומנים²⁷, פותחו כדי להשיג את השינויים שלאחר התרגום לעיל. בנוסף, שולבו מגוון תוספים כגון מלווים מולקולריים²⁸ ומייצבים כימיים כדי לסייע בקיפול חלבוני מטרה, ולתרום לגיוון מערכות CFPS. הבקטריופאג’ T7 RNA פולימראז, הידוע בתהליכיות הגבוהה שלו, משמש בעיקר לשעתוק, אם כי פולימרזות אחרות כגון SP6²⁹ שימשו גם כן. E. coli אנדוגני RNA פולימראז הותאם לאב טיפוס של מעגלים גנטיים הממנפים גורמי סיגמא³⁰. לבסוף, מגוון של מבשרי אנרגיה 31,32,33 ומלחים שונים ורכיבי חיץ 19,34,35 עברו אופטימיזציה שיטתית כדי לשפר את הפרודוקטיביות.

מלבד מערכת CFPS עצמה, שיטות האנקפסולציה כמו גם חומרי המידור חיוניים גם להרכבת תאים סינתטיים מוצלחת. מערכות שונות שפותחו כדי לתמצת בהצלחה את תגובת CFPS כוללות טיפות מים/שמן המיוצבות על ידי פעילי שטח, ליפידים/פולימר ושלפוחיות חד-למלריות היברידיות שלהן (בקטרים הנעים בין 50 ננומטר למספר מיקרומטר), כמו גם דו-שכבות ליפידים הנתמכות על ידי מישורים. עם זאת, בשל תכולת המולקולות המורכבות של מערכת CFPS, שיעור ההצלחה של אנקפסולציה תלוי במקרים ספציפיים, במיוחד עבור היווצרות שלפוחיות. כדי לשפר את שיעור ההצלחה והיעילות של אנקפסולציה של CFPS, שבבי microfluid שונים פותחו כדי להקל על היווצרות של טיפות ובועיות³⁶. עם זאת, יהיה צורך להקים שבבים ומכשירים נוספים.

פרוטוקול זה מתאר מערכת E . coli CFPS המשתמשת בזן BL21(DE3), שהוא מארח נפוץ לייצור חלבונים רקומביננטיים. הפרוטוקול כולל תיאור מפורט של הכנת תמצית התא, הכנת תבנית ואופטימיזציה סטנדרטית של ביטויים באמצעות חלבון מדווח פלואורסצנטי. יתר על כן, אנו מציגים תוצאות מופתיות שהושגו על ידי עטיפת מערכת CFPS בתוך מיקרו-תאים מגוונים, כולל טיפות חד-שכבתיות, שלפוחיות תחליב כפולות ותאים הממוקמים על גבי דו-שכבות שומנים נתמכות. לבסוף, אנו מסבירים את המרכיבים הפרוצדורליים המרכזיים ואת התנאים ההכרחיים להקמה מוצלחת של מערכות CFPS אלה בהקשרים סביבתיים נפרדים.