Система бесклеточного синтеза белка для построения синтетических клеток

Синтез синтетических или искусственных клеток стал очень заметной областью междисциплинарных исследований, привлекая значительный интерес со стороны ученых в области синтетической биологии, химии и биофизики. Эти ученые объединены общей целью построения минимальной живой клетки ^1,2,3. Быстрый рост этой области идет в ногу со значительными достижениями в критических технологиях, таких как манипуляции с рекомбинантной ДНК⁴, биомиметические материалы⁵ и методы микропроизводства для компартментализации⁶, включая метод синтеза бесклеточных белков (CFPS)⁷. Системы CFPS включают в себя основные клеточные механизмы для транскрипции и трансляции, обеспечивая основополагающую основу для разработки и интеграции многофункциональных искусственных клеток.

Несмотря на то, что методы CFPS часто используются при сборке синтетических элементов, разработка надежной и специализированной системы CFPS для сборки различных систем синтетических клеток остается сложной задачей. В настоящее время доступны многочисленные системы CFPS, полученные как от прокариот, так и от модельных организмов^{эукариот 8}, каждая из которых специализируется на конкретных приложениях в синтезе синтетических клеток. Помимо своей центральной роли в транскрипции и переводе, системы CFPS различаются по своим основным компонентам и связанным с ними процедурам подготовки. Эти вариации, которые включают различия в клеточных экстрактах, РНК-полимеразах, методах подготовки матриц и буферных композициях, в значительной степени обусловлены различными траекториями развития, которые преследовали исследовательские группы, интенсивно оптимизировавшие свои системы для максимального выхода белка.

Среди различных компонентов системы CFPS экстракт клеток является критически важным ферментативным пулом для транскрипции и трансляции и, таким образом, ключевым фактором, определяющим эффективность CFPS⁹. CFPS на основе Escherichia coli (E. coli) является наиболее часто используемой системой из-за ее статуса наиболее изученного прокариотического организма. Кроме того, исследовательская группа Уэда разработала полностью восстановленную систему CFPS, состоящую из индивидуально очищенных белков и рибосом, известную как PURE¹⁰, которая особенно подходит для приложений, требующих четкого фона. В настоящее время даже системы CFPS на основе E. coli диверсифицированы, особенно с точки зрения исходных штаммов экстрак¹¹ и методов получения^12,13, РНК-полимеразы^14,15, источников энергии^16,17 и буферных систем^18,19. К наиболее часто используемым штаммам относятся производные штаммов K12 и B, такие как A19²⁰, JM109²¹, BL21 (DE3) ²² и Rossetta2²³, а также их генетически модифицированные аналоги.

Первоначально штаммы E. coli со сниженной активностью РНКазы и протеазы были выбраны для повышения стабильности мРНК и стабильности вновь синтезированных рекомбинантных белков, что привело к увеличению конечного выхода белка²⁴. Впоследствии были разработаны экстракты E. coli для облегчения специфических посттрансляционных модификаций, включая гликозилирование²⁵, фосфорилирование²⁶ и липидирование²⁷, которые были разработаны для достижения вышеупомянутых посттрансляционных модификаций. Кроме того, ряд добавок, таких как молекулярные шапероны²⁸ и химические стабилизаторы, был включен для содействия сворачиванию целевых белков, способствуя диверсификации систем CFPS. РНК-полимераза бактериофага Т7, известная своей высокой технологичностью, преимущественно используется для транскрипции, хотя используются и другие полимеразы, такие как SP6²⁹. Эндогенная РНК-полимераза E. coli была адаптирована для прототипирования генетических цепей с использованием сигма-факторов³⁰. Наконец, различные прекурсоры энергии 31,32,33 и различные соли и буферные компоненты 19,34,35 были систематически оптимизированы для повышения производительности.

Помимо самой системы CFPS, методы инкапсуляции, а также материалы для компартментализации также имеют жизненно важное значение для успешной сборки синтетических ячеек. Различные системы, которые были разработаны для успешной инкапсуляции реакции CFPS, включают стабилизированные поверхностно-активным веществом капли воды/масла, липиды/полимеры и их гибридные униламеллярные везикулы (диаметром от 50 нм до нескольких мкм), а также планарно-поддерживаемые липидные бислои. Однако, из-за содержания сложных молекул в системе CFPS, вероятность успеха инкапсуляции зависит от конкретных случаев, в частности, для образования везикул. Для повышения коэффициента успешности и эффективности инкапсуляции CFPS были разработаны различные микрофлюидные чипы, способствующие образованию как капель, так и везикул³⁶. Тем не менее, необходимо будет установить дополнительные чипы и устройства.

Этот протокол описывает систему CFPS E. coli , использующую штамм BL21(DE3), который обычно используется в качестве хозяина для производства рекомбинантных белков. Протокол включает в себя подробный отчет о подготовке клеточного экстракта, подготовке матрицы и стандартной оптимизации экспрессии с использованием флуоресцентного репортерного белка. Кроме того, мы представляем примеры результатов, достигнутых путем инкапсуляции системы CFPS в различные микрокомпартменты, включая монослойные капли, двойные эмульсионные везикулы и камеры, расположенные поверх поддерживаемых липидных бислоев. Наконец, мы подробно останавливаемся на ключевых процедурных элементах и необходимых условиях, необходимых для успешного создания этих систем CFPS в различных экологических контекстах.