Cell-Free Protein Synthesis System for Building Synthetic Cells

Mengjiao Cao; Mengmeng Yang; Yingqiu Li; Ke Yue; Lulu Shen; Lei Kai

doi:10.3791/66626

JoVE Journal > Biochemistry

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Biochemistry

نظام تخليق البروتين الخالي من الخلايا لبناء الخلايا الاصطناعية

Published: April 19, 2024

doi:

10.3791/66626

Mengjiao Cao*¹, Mengmeng Yang*¹, Yingqiu Li*¹, Ke Yue¹, Lulu Shen¹, Lei Kai¹

¹School of Life Sciences,Jiangsu Normal University

Summary

يصف هذا البروتوكول نظام تخليق البروتين الخالي من الخلايا (CFPS) المستخدم في بناء الخلايا الاصطناعية. يحدد المراحل الرئيسية مع النتائج التمثيلية في مقصورات صغيرة مختلفة. يهدف البروتوكول إلى إنشاء أفضل الممارسات للمختبرات المتنوعة في مجتمع الخلايا الاصطناعية ، مما يعزز التقدم في تطوير الخلايا الاصطناعية.

Abstract

تم استخدام نظام تخليق البروتين الخالي من الخلايا (CFPS) على نطاق واسع لتسهيل التجميع من أسفل إلى أعلى للخلايا الاصطناعية. إنه بمثابة المضيف للآلية الأساسية ل Central Dogma ، حيث يقف كهيكل مثالي لدمج وتجميع أنظمة التقليد الخلوية الاصطناعية المتنوعة. على الرغم من استخدامه المتكرر في تصنيع الخلايا الاصطناعية ، فإن إنشاء نظام CFPS مصمم وقوي لتطبيق معين لا يزال يمثل تحديا غير بسيط. في ورقة الطرق هذه ، نقدم بروتوكولا شاملا لنظام CFPS ، يستخدم بشكل روتيني في بناء الخلايا الاصطناعية. يشمل هذا البروتوكول المراحل الرئيسية في إعداد نظام CFPS ، بما في ذلك مستخلص الخلية ، وإعداد القالب ، وتحسين التعبير الروتيني باستخدام بروتين مراسل الفلورسنت. بالإضافة إلى ذلك ، نعرض نتائج تمثيلية من خلال تغليف نظام CFPS داخل مقصورات دقيقة مختلفة ، مثل قطرات أحادية الطبقة ، وحويصلات مستحلب مزدوج ، وغرف تقع فوق طبقات الدهون المزدوجة المدعومة. أخيرا ، نوضح الخطوات والشروط الحاسمة اللازمة للتجميع الناجح لأنظمة CFPS هذه في بيئات متميزة. نتوقع أن يسهل نهجنا إنشاء ممارسات عمل جيدة بين مختلف المختبرات داخل مجتمع الخلايا الاصطناعية المتوسع باستمرار ، وبالتالي تسريع التقدم في مجال تطوير الخلايا الاصطناعية.

Introduction

برز تخليق الخلايا الاصطناعية أو الاصطناعية كمجال بارز للغاية للبحوث متعددة التخصصات ، وجذب اهتماما كبيرا من العلماء عبر مجالات البيولوجيا التركيبية والكيمياء والفيزياء الحيوية. يتحد هؤلاء العلماء من خلال الهدف المشترك المتمثل في بناء الحد الأدنى من الخلايا الحية¹^،²^،³. كان النمو السريع لهذا المجال متماشيا مع التطورات الكبيرة في التقنيات الحيوية ، مثل معالجة الحمض النووي المؤتلف⁴ ، ومواد المحاكاة الحيوية⁵ ، وتقنيات التصنيع الدقيق للتجزئة⁶ ، بما في ذلك طريقة تخليق البروتين الخالي من الخلايا (CFPS)⁷. تشمل أنظمة CFPS الآلية الخلوية الأساسية للنسخ والترجمة ، مما يوفر الإطار الأساسي لتطوير وتكامل الخلايا الاصطناعية متعددة الوظائف.

على الرغم من أن تقنيات CFPS تستخدم بشكل متكرر في تجميع الخلايا الاصطناعية ، إلا أن تطوير نظام CFPS قوي ومصمم خصيصا لتجميع أنظمة الخلايا الاصطناعية المختلفة لا يزال يمثل تحديا معقدا. حاليا ، تتوفر العديد من أنظمة CFPS ، مشتقة من كل من بدائيات النوى والكائنات الحية^{النموذجية 8} ، كل منها متخصص لتطبيقات معينة في تخليق الخلايا الاصطناعية. بالإضافة إلى أدوارها المركزية في النسخ والترجمة ، تختلف أنظمة CFPS في مكوناتها الرئيسية وإجراءات الإعداد المرتبطة بها. هذه الاختلافات ، التي تشمل الاختلافات في مستخلصات الخلايا ، وبوليميراز الحمض النووي الريبي ، وطرق تحضير القوالب ، والتركيبات العازلة ، ترجع إلى حد كبير إلى مسارات التطوير المتميزة التي تتبعها مجموعات البحث التي حسنت أنظمتها بشكل مكثف لتحقيق أقصى إنتاجية من البروتين.

من بين المكونات المختلفة لنظام CFPS ، يعد مستخلص الخلية مجموعة إنزيمية مهمة للنسخ والترجمة ، وبالتالي فهو محدد رئيسي لأداء CFPS⁹. يعد نظام CFPS القائم على الإشريكية القولونية (E. coli) هو النظام الأكثر استخداما نظرا لوضعه كأفضل كائن بدائي النواة مفهوما. علاوة على ذلك ، تم تطوير نظام CFPS المعاد تشكيله بالكامل والذي يتألف من البروتينات والريبوسومات المنقاة بشكل فردي ، والمعروفة باسم PURE¹⁰ ، من قبل مجموعة أبحاث Ueda ، وهو مناسب بشكل خاص للتطبيقات التي تتطلب خلفية واضحة. اليوم ، حتى أنظمة CFPS القائمة على الإشريكية القولونية قد تنوعت ، خاصة من حيث سلالات المصدر للإكستراك¹¹ وطرق التحضير^12,13 ، بوليميراز الحمض النووي الريبي^14,15 ، مصادر الطاقة^16,17 ، والأنظمة العازلة^18,19. تشمل السلالات الأكثر استخداما مشتقات سلالة K12 و B ، مثل A19²⁰ و JM109²¹ و BL21 (DE3) ²² و Rossetta2²³ ، إلى جانب نظيراتها المعدلة وراثيا.

في البداية ، تم اختيار سلالات الإشريكية القولونية ذات أنشطة RNase والبروتياز المنخفضة لتعزيز استقرار mRNA واستقرار البروتينات المؤتلفة المركبة حديثا ، مما يؤدي إلى زيادة إنتاجية البروتين النهائية²⁴. بعد ذلك ، تم تصميم مستخلصات الإشريكية القولونية لتسهيل تعديلات محددة بعد الترجمة ، بما في ذلك الجليكوزيل²⁵ والفسفرة²⁶ والدهون²⁷ ، لتحقيق تعديلات ما بعد الترجمة المذكورة أعلاه. بالإضافة إلى ذلك ، تم دمج مجموعة من المواد المضافة مثل المرافقات الجزيئية²⁸ والمثبتات الكيميائية للمساعدة في طي البروتينات المستهدفة ، مما يساهم في تنويع أنظمة CFPS. يتم استخدام بوليميراز الحمض النووي الريبي T7 البكتيري ، المعروف بعمليته العالية ، في الغالب للنسخ ، على الرغم من استخدام بوليميراز آخر مثل SP6²⁹ . تم تكييف بوليميراز الحمض النووي الريبي الداخلي الإشريكية القولونية للنماذج الأولية للدوائر الجينية التي تستفيد من عوامل سيجما³⁰. أخيرا ، تم تحسين مجموعة متنوعة من سلائف الطاقة³¹^،³²^،³³ والأملاح المختلفة والمكونات العازلة¹⁹^،³⁴^،³⁵ بشكل منهجي لتعزيز الإنتاجية.

إلى جانب نظام CFPS نفسه ، فإن طرق التغليف وكذلك مواد التقسيم ضرورية أيضا لتجميع الخلايا الاصطناعية الناجح. تشمل الأنظمة المختلفة التي تم تطويرها لتغليف تفاعل CFPS بنجاح قطرات الماء / الزيت المستقرة بالسطحي ، والدهون / البوليمر ، وحويصلاتها الهجينة أحادية الصفيحة (بأقطار تتراوح من 50 نانومتر إلى عدة ميكرومتر) ، بالإضافة إلى طبقات ثنائية دهنية مدعومة بشكل مستو. ومع ذلك ، نظرا لمحتوى الجزيء المعقد لنظام CFPS ، يعتمد معدل نجاح التغليف على حالات محددة ، خاصة لتشكيل الحويصلات. لتحسين معدل نجاح وكفاءة تغليف CFPS ، تم تطوير العديد من رقائق الموائع الدقيقة لتسهيل تكوين كل من القطرات والحويصلات³⁶. ومع ذلك ، يجب إنشاء رقائق وأجهزة إضافية.

يحدد هذا البروتوكول نظام E. coli CFPS باستخدام سلالة BL21 (DE3) ، وهي مضيف شائع الاستخدام لإنتاج البروتين المؤتلف. يشمل البروتوكول سردا مفصلا لإعداد مستخلص الخلية ، وإعداد القالب ، وتحسين التعبير القياسي باستخدام بروتين مراسل الفلورسنت. علاوة على ذلك ، نقدم نتائج مثالية تم تحقيقها من خلال تغليف نظام CFPS داخل مقصورات دقيقة متنوعة ، بما في ذلك قطرات أحادية الطبقة ، وحويصلات مستحلب مزدوجة ، وغرف تقع فوق طبقات الدهون المزدوجة المدعومة. وأخيرا، نوضح العناصر الإجرائية المحورية والشروط اللازمة التي لا غنى عنها للنجاح في إنشاء أنظمة CFPS هذه في سياقات بيئية متميزة.

Protocol

1. استخراج التحضير قم بخط سلالة E. coli BL21 (DE3) من مخزون الجلسرين على صفيحة أجار Luria Bertani (LB) واحتضانها لمدة 15 ساعة على الأقل عند 37 درجة مئوية. قم بإعداد مزرعة مسبقة بين عشية وضحاها عن طريق تلقيح مستعمرة واحدة من صفيحة LB المحضرة حديثا في قارورة سعة 50 مل من …

Representative Results

لكل دفعة جديدة من مستخلص الخلايا وبوليميراز T7 RNA ، يوصى بإجراء فحص أساسي لكل من تركيزات Mg2+ و K + لضمان الأداء الأمثل لنظام CFPS. يمكن أن يكون مضان GFP للمجلد الفائق بمثابة مؤشر للعائد الإجمالي لنظام CFPS في ظل ظروف مختلفة ، كما هو موضح في الشكل 1A ، …

Discussion

تحدد هذه المخطوطة نظاما معدلا لتخليق البروتين الخالي من الخلايا (CFPS) مصمما للاستخدام في العديد من المقصورات الدقيقة عبر منصات الخلايا الاصطناعية ، بما في ذلك قطرات الماء في الزيت ، و GUVs ، و SLBs. استخدمنا سلالة مضيف تعبير البروتين المؤتلف E. coli القياسية ، BL21 (DE3) ، كمستخل…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

يقر م. ي. بالتمويل المقدم من برنامج البحث والابتكار في الدراسات العليا في مقاطعة جيانغسو ، الصين (المنحة رقم. KYCX22_2803). LK ممتن لدعم أبحاث العلوم الطبيعية لمؤسسات التعليم العالي في جيانغسو في الصين ، الصين (منحة رقم 17KJB180003) ، ومؤسسة العلوم الطبيعية بجامعة جيانغسو نورمال ، الصين (منحة رقم 17XLR037) ، وتطوير البرنامج الأكاديمي ذي الأولوية لمؤسسات التعليم العالي في جيانغسو ، الصين ، وبرنامج جيانغسو للأستاذ المعين خصيصا ، الصين.

Materials

1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine(DOPC)	Avanti	850375P
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt)(DOPS)	Avanti	840035P
1,4 dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	1.11474
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC)	Avanti	850457P
3,5-cyclic AMP (cAMP)	Sigma-Aldrich	A9501
50 mL tubes	Eppendorf	Eppendorf Tubes BioBased
50% hydrogen peroxide	Sigma-Aldrich	516813
Acetate	Sigma-Aldrich	A6283
Agar powder	Sigma-Aldrich	05040
Alanin	Sigma-Aldrich	A4349
Amicon Stirred Cells	MerckMillipore	UFSC05001
Ammonium acetate (NH4OAc)	Sigma-Aldrich	A7262
Arginin	Sigma-Aldrich	A4474
Asparagin	Sigma-Aldrich	A0884
Aspartat	Sigma-Aldrich	A5474
ATP	Roche	11140965001
Atto 488 DOPE	Sigma-Aldrich	67335
Atto 647N DOPE	Sigma-Aldrich	42247
Baffled Erlenmeyer flask	Shuniu	250 mL, 1000mL
Bovine Serum Albumin(BSA)	Roche	10711454001
Centrifugetube	Eppendorf	Eppendorf Tubes 3810X
Centrifugetube rack	Eppendorf	0030119819
Chemiluminescence and epifluorescence imaging system	Uvitec	Alliance Q9 Advanced
Chloroform	Sigma-Aldrich	288306
Confocal Laser Scanning Microscopy (LSM)	ZEISS	LSM 780
Countess Cell Counting Chamber Slides	Thermo Fisher Scientific	C10283
Coverslip	Thermo Scientific	Menzel BB02400500A113MNZ0
creatine kinase (CK)	Roche	10127566001
Creatine phosphate (CP)	Sigma-Aldrich	10621714001
Culture dish	Huanqiu	90 mm
Cystein	Sigma-Aldrich	C5360
Cytidine 5'-triphosphate disodium salt (CTP)	aladdin	C101487
Dialysis membrane	Spectrum	Standard RC Tubing MWCO: 12-14 kD
E.Z.N.A. Cycle Pure Kit	Omega Bio-Tek	D6492-01
Electro-Heating Standing-Temperature Cultivator	Yiheng instrument	DHP-9602
Ethylenediaminetetraacetic acid(EDTA)	Biosharp	1100027
Fluorescent plate reader	BioTek	Synergy 2
Fluorinated oil	Suzhou CChip scientific instrument	2%HFE7500
Folinic acid	Sigma-Aldrich	47612
French Press	G.Heinemann	HTU-DIGI-Press
Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
Glutamat	Sigma-Aldrich	G5667
Glutamin	Sigma-Aldrich	G5792
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
Glycin	Sigma-Aldrich	G7126
Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate(GTP)	Roche	10106399001
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
HiPrep Q FF 16/10	Cytiva	28936543
Histidin	Sigma-Aldrich	H6034
Isoleucin	Sigma-Aldrich	I5281
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG)	Sigma-Aldrich	I5502
K₂HPO₄	Sigma-Aldrich	P8281
KH₂PO₄	Sigma-Aldrich	P5655
Leucin	Sigma-Aldrich	L6914
Lysin	Sigma-Aldrich	L5501
Magnesium acetate tetrahydrate (Mg(OAc)₂ )	Sigma-Aldrich	M5661
Magnesium chloride(MgCl₂)	Sigma-Aldrich	M2670
Methionin	Sigma-Aldrich	M8439
Microcentrifuge	Eppendorf	5424 R
Mineral oil	Sigma-Aldrich	M5904
Mini-PROTEAN Tetra Cell Systems	Bio-Rad	1645050
Multipurpose Centrifuge	Eppendorf	5810 R
NaN3	Sigma-Aldrich	S2002
Nucleic Acid & Protein UV-Assay Measurements	IMPLEN	NanoPhotometer N60
NucleoBond Xtra Maxi kit for transfection-grade plasmid DNA	MACHEREY-NAGEL	740414.5
Nunc-Immuno MicroWell 96 well polystyrene plates	Sigma-Aldrich	P8616
PCR Thermal Cycler	Eppendorf	Mastercycler nexus
Peptone	Sigma-Aldrich	83059
Phenylalanin	Sigma-Aldrich	P8740
Phosphoenolpyruvat (PEP)	GLPBIO	GC44635
PMSF	Sigma-Aldrich	PMSF-RO
Polyethylene glycol 8000 (PEG 8000)	Sigma-Aldrich	89510
Potassium Acetate(KOAc)	Sigma-Aldrich	P5708
Potassium chloride(KCl)	Sigma-Aldrich	P9541
Potassium glutamate (K-glutamate)	Sigma-Aldrich	G1501
Potassium hydroxide(KOH)	Sigma-Aldrich	221473
Prolin	Sigma-Aldrich	P8865
Pyruvate kinase (PK)	Sigma-Aldrich	P9136
Serin	Sigma-Aldrich	S4311
Shaker	Zhichushakers	ZQZY-AF8
Sodium chloride(NaCl)	Sigma-Aldrich	S5886
Sodium hydroxide(NaOH)	Sigma-Aldrich	S5881
Sucrose	aladdin	S112226
Sulfuric acid	Sigma-Aldrich	339741
Syringe Filters	Jinteng	0.45 μm
Test tube	Shuniu	20 mL
TGX FastCast Acrylamide Kit, 12%	Bio-Rad	#1610175
ThermoMixer	Eppendorf	ThermoMixer C
Threonin	Sigma-Aldrich	T8441
Tris base	Sigma-Aldrich	V900483
tRNA	Roche	10109550001
Tryptone	Sigma-Aldrich	T7293
Tryptophan	Sigma-Aldrich	T8941
Tyrosin	Sigma-Aldrich	T8566
UTP Trisodium salt (UTP)	aladdin	U100365
Vacuum Pump with Circulated Water System	Zhengzhou Greatwall Scientific Industrial and Trade Co.Ltd	SHB-
Valin	Sigma-Aldrich	V4638
Vortex Mixers	Kylin-Bell	Vortex QL-861
Water purification system	MerckMillipore	Direct ultrapure water (Type 1)
Yeast extract	Sigma-Aldrich	70161
β-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	444203

References

Elani, Y. Interfacing living and synthetic cells as an emerging frontier in synthetic biology. Angew Chem Int Ed Engl. 60 (11), 5602-5611 (2021).
Cho, E., Lu, Y. Compartmentalizing cell-free systems: toward creating life-like artificial cells and beyond. ACS Synth Biol. 9 (11), 2881-2901 (2020).
Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications. Nat Rev Genet. 21 (3), 151-170 (2020).
Zhang, L., Guo, W., Lu, Y. Advances in cell-free biosensors: principle, mechanism, and applications. Biotechnol J. 15 (9), e2000187 (2020).
Lu, Y., Allegri, G., Huskens, J. Vesicle-based artificial cells: materials, construction methods and applications. Mater Horiz. 9 (3), 892-907 (2022).
Fu, Z., Ochsner, M. A., De Hoog, H. P., Tomczak, N., Nallani, M. Multicompartmentalized polymersomes for selective encapsulation of biomacromolecules. Chem Commun (Camb). 47 (10), 2862-2864 (2011).
Ayoubi-Joshaghani, M. H., et al. Cell-free protein synthesis: the transition from batch reactions to minimal cells and microfluidic devices. Biotechnol Bioeng. 117 (4), 1204-1229 (2020).
Yue, K., Chen, J. Y., Li, Y. Q., Kai, L. Advancing synthetic biology through cell-free protein synthesis. Comput Struct Biotechnol J. 21, 2899-2908 (2023).
Kwon, Y. C., Jewett, M. C. High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis. Sci Rep. 5, 8663 (2015).
Shimizu, Y., et al. Cell-free translation reconstituted with purified components. Nat Biotechnol. 19 (8), 751-755 (2001).
Schwarz, D., et al. Preparative scale expression of membrane proteins in Escherichia coli-based continuous exchange cell-free systems. Nat Protoc. 2 (11), 2945-2957 (2007).
Levine, M. Z., Gregorio, N. E., Jewett, M. C., Watts, K. R., Oza, J. P. Escherichia coli-based cell-free protein synthesis: protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology. J Vis Exp. (144), e58882 (2019).
Cole, S. D., Miklos, A. E., Chiao, A. C., Sun, Z. Z., Lux, M. W. Methodologies for preparation of prokaryotic extracts for cell-free expression systems. Synth Syst Biotechnol. 5 (4), 252-267 (2020).
Shin, J., Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous E. coli RNA polymerase and sigma factor 70. J Biol Eng. 4, 8 (2010).
Mcmanus, J. B., Emanuel, P. A., Murray, R. M., Lux, M. W. A method for cost-effective and rapid characterization of engineered T7-based transcription factors by cell-free protein synthesis reveals insights into the regulation of T7 RNA polymerase-driven expression. Arch Biochem Biophys. 674, 108045 (2019).
Kim, T. W., et al. Prolonged cell-free protein synthesis using dual energy sources: combined use of creatine phosphate and glucose for the efficient supply of ATP and retarded accumulation of phosphate. Biotechnol Bioeng. 97 (6), 1510-1515 (2007).
Kim, D. M., Swartz, J. R. Regeneration of adenosine triphosphate from glycolytic intermediates for cell-free protein synthesis. Biotechnol Bioeng. 74 (4), 309-316 (2001).
Liu, Y., Fritz, B. R., Anderson, M. J., Schoborg, J. A., Jewett, M. C. Characterizing and alleviating substrate limitations for improved in vitro ribosome construction. ACS Synth Biol. 4 (4), 454-462 (2015).
Rasor, B. J., et al. Mechanistic insights into cell-free gene expression through an integrated-omics analysis of extract processing methods. ACS Synth Biol. 12 (2), 405-418 (2023).
Kim, D. M., Kigawa, T., Choi, C. Y., Yokoyama, S. A highly efficient cell-free protein synthesis system from Escherichia coli. Eur J Biochem. 239 (3), 881-886 (1996).
Li, J. J., Li, P. X., Liu, Q., Li, J. J., Qi, H. Translation initiation consistency between in vivo and in vitro bacterial protein expression systems. Front Bioeng Biotechnol. 11, 1201580 (2023).
Shrestha, P., Holland, T. M., Bundy, B. C. Streamlined extract preparation for Escherichia coli-based cell-free protein synthesis by sonication or bead vortex mixing. Biotechniques. 53 (3), 163-174 (2012).
Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based tx-tl cell-free expression system for synthetic biology. J Vis Exp. (79), e50762 (2013).
Zubay, G. In vitro synthesis of protein in microbial systems. Annu Rev Genet. 7, 267-287 (1973).
Jaroentomeechai, T., et al. Single-pot glycoprotein biosynthesis using a cell-free transcription-translation system enriched with glycosylation machinery. Nat Commun. 9 (1), 2686 (2018).
Katsura, K., et al. Phosphorylated and non-phosphorylated HCK kinase domains produced by cell-free protein expression. Protein Expr Purif. 150, 92-99 (2018).
Suzuki, T., et al. N-terminal protein modifications in an insect cell-free protein synthesis system and their identification by mass spectrometry. Proteomics. 6 (16), 4486-4495 (2006).
Chi, H., Wang, X., Li, J., Ren, H., Huang, F. Chaperonin-enhanced Escherichia coli cell-free expression of functional CXCR4. J Biotechnol. 231, 193-200 (2016).
Endo, Y., Sawasaki, T. High-throughput, genome-scale protein production method based on the wheat germ cell-free expression system. Biotechnol Adv. 21 (8), 695-713 (2003).
Shin, J., Noireaux, V. An E. coli cell-free expression toolbox: Application to synthetic gene circuits and artificial cells. ACS Synth Biol. 1 (1), 29-41 (2012).
Jewett, M. C., Swartz, J. R. Mimicking the Escherichia coli cytoplasmic environment activates long-lived and efficient cell-free protein synthesis. Biotechnol Bioeng. 86 (1), 19-26 (2004).
Ryabova, L. A., Vinokurov, L. M., Shekhovtsova, E. A., Alakhov, Y. B., Spirin, A. S. Acetyl phosphate as an energy source for bacterial cell-free translation systems. Anal Biochem. 226 (1), 184-186 (1995).
Guzman-Chavez, F., et al. Constructing cell-free expression systems for low-cost access. ACS Synth Biol. 11 (3), 1114-1128 (2022).
Jewett, M. C., Swartz, J. R. Substrate replenishment extends protein synthesis with an in vitro translation system designed to mimic the cytoplasm. Biotechnol Bioeng. 87 (4), 465-472 (2004).
Caschera, F., et al. High-throughput optimization cycle of a cell-free ribosome assembly and protein synthesis system. ACS Synth Biol. 7 (12), 2841-2853 (2018).
Yue, K., et al. Bottom-up synthetic biology using cell-free protein synthesis. Adv Biochem Eng Biotechnol. 185, 1-20 (2023).
Liu, D. V., Zawada, J. F., Swartz, J. R. Streamlining Escherichia coli S30 extract preparation for economical cell-free protein synthesis. Biotechnol Prog. 21 (2), 460-465 (2005).
Kim, T. W., et al. Simple procedures for the construction of a robust and cost-effective cell-free protein synthesis system. J Biotechnol. 126 (4), 554-561 (2006).
McPhie, P. [4] Dialysis. Methods Enzymol. 22, 23-32 (1971).
Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J Vis Exp. (6), e253 (2007).
Kai, L., et al. Systems for the cell-free synthesis of proteins. Methods Mol Biol. 800, 201-225 (2012).
Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. J Extracell Vesicles. 4, 27031 (2015).
Hori, Y., Kantak, C., Murray, R. M., Abate, A. R. Cell-free extract based optimization of biomolecular circuits with droplet microfluidics. Lab Chip. 17 (18), 3037-3042 (2017).
Takahashi, H., Ogawa, A. Preparation of a millimeter-sized supergiant liposome that allows for efficient, eukaryotic cell-free translation in the interior by spontaneous emulsion transfer. ACS Synth Biol. 9 (7), 1608-1614 (2020).
Adir, O., et al. Preparing protein producing synthetic cells using cell free bacterial extracts, liposomes and emulsion transfer. J Vis Exp. (158), e60829 (2020).
Kai, L., Dotsch, V., Kaldenhoff, R., Bernhard, F. Artificial environments for the co-translational stabilization of cell-free expressed proteins. PLoS One. 8 (2), e56637 (2013).
Kai, L., Sonal, H. T., Schwille, P. Reconstitution of a reversible membrane switch via prenylation by one-pot cell-free expression. ACS Synth Biol. 12 (1), 108-119 (2023).
Foshag, D., et al. The E. Coli S30 lysate proteome: a prototype for cell-free protein production. N Biotechnol. 40, 245-260 (2018).
Garenne, D., Beisel, C. L., Noireaux, V. Characterization of the all-E. coli transcription-translation system mytxtl by mass spectrometry. Rapid Commun Mass Spectrom. 33 (11), 1036-1048 (2019).
Puigbo, P., Guzman, E., Romeu, A., Garcia-Vallve, S. Optimizer: A web server for optimizing the codon usage of DNA sequences. Nucleic Acids Res. 35, W126-W131 (2007).
Wiegand, D. J., Lee, H. H., Ostrov, N., Church, G. M. Cell-free protein expression using the rapidly growing bacterium vibrio natriegens. J Vis Exp. (145), e59495 (2019).
Calhoun, K. A., Swartz, J. R. An economical method for cell-free protein synthesis using glucose and nucleoside monophosphates. Biotechnol Prog. 21 (4), 1146-1153 (2005).
Kim, D. M., Swartz, J. R. Prolonging cell-free protein synthesis with a novel ATP regeneration system. Biotechnol Bioeng. 66 (3), 180-188 (1999).
Nishimura, K., et al. Cell-free protein synthesis inside giant unilamellar vesicles analyzed by flow cytometry. Langmuir. 28 (22), 8426-8432 (2012).
Teh, S. Y., Khnouf, R., Fan, H., Lee, A. P. Stable, biocompatible lipid vesicle generation by solvent extraction-based droplet microfluidics. Biomicrofluidics. 5 (4), 044113 (2011).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Cao, M., Yang, M., Li, Y., Yue, K., Shen, L., Kai, L. Cell-Free Protein Synthesis System for Building Synthetic Cells. J. Vis. Exp. (206), e66626, doi:10.3791/66626 (2024).

Automatically Generated