Sistema de síntesis de proteínas libres de células para la construcción de células sintéticas

La síntesis de células sintéticas o artificiales se ha convertido en un campo muy destacado de investigación interdisciplinaria, que atrae un interés sustancial de los científicos de todos los dominios de la biología sintética, la química y la biofísica. Estos científicos están unidos por el objetivo común de construir una célula viva mínima ^1,2,3. El rápido crecimiento de este campo ha ido en sintonía con avances significativos en tecnologías críticas, como la manipulación del ADN recombinante⁴, los materiales biomiméticos⁵ y las técnicas de microfabricación para la compartimentación⁶, incluido el método de síntesis de proteínas libres de células (CFPS)⁷. Los sistemas CFPS abarcan la maquinaria celular esencial para la transcripción y la traducción, proporcionando el marco fundamental para el desarrollo y la integración de células artificiales multifuncionales.

Aunque las técnicas de CFPS se utilizan con frecuencia en el ensamblaje de células sintéticas, el desarrollo de un sistema de CFPS robusto y adaptado para el ensamblaje de varios sistemas de células sintéticas sigue siendo un desafío complejo. En la actualidad, se dispone de numerosos sistemas de CFPS, derivados de organismos modelo tanto procariotas como eucariotas⁸, cada uno especializado para aplicaciones particulares en la síntesis de células sintéticas. Más allá de sus funciones centrales en la transcripción y la traducción, los sistemas CFPS varían en sus componentes principales y en los procedimientos de preparación asociados. Estas variaciones, que incluyen diferencias en los extractos celulares, las ARN polimerasas, los métodos de preparación de plantillas y las composiciones de los tampones, se deben en gran medida a las distintas trayectorias de desarrollo seguidas por los grupos de investigación que han optimizado intensamente sus sistemas para obtener el máximo rendimiento de proteínas.

Entre los diversos componentes del sistema CFPS, el extracto celular es un grupo enzimático crítico para la transcripción y la traducción y, por lo tanto, un determinante clave del rendimiento de CFPS⁹. El CFPS basado en Escherichia coli (E. coli) es el sistema más utilizado debido a su condición de organismo procariota mejor comprendido. Además, el grupo de investigación de Ueda ha desarrollado un sistema de CFPS totalmente reconstituido que comprende proteínas y ribosomas purificados individualmente, conocido como PURE¹⁰, que es especialmente adecuado para aplicaciones que requieren un fondo claro. Hoy en día, incluso los sistemas de CFPS basados en E. coli se han diversificado, especialmente en términos de las cepas fuente para el extracto¹¹ y los métodos de preparación^12,13, ARN polimerasa^14,15, fuentes de energía^16,17 y sistemas tampón^18,19. Las cepas más utilizadas incluyen derivados de la cepa K12 y B, como A19²⁰, JM109²¹, BL21 (DE3)²² y Rossetta2²³, junto con sus contrapartes modificadas genéticamente.

Inicialmente, se eligieron cepas de E. coli con actividades reducidas de ARNasa y proteasa para mejorar la estabilidad del ARNm y la estabilidad de las proteínas recombinantes recién sintetizadas, lo que condujo a un mayor rendimiento final de proteínas²⁴. Posteriormente, los extractos de E. coli se diseñaron para facilitar modificaciones postraduccionales específicas, incluida la glicosilación²⁵, la fosforilación²⁶ y la lipidación²⁷, para lograr las modificaciones postraduccionales anteriores. Además, se han incorporado una serie de aditivos como acompañantes moleculares²⁸ y estabilizadores químicos para ayudar al plegamiento de las proteínas objetivo, lo que contribuye a la diversificación de los sistemas CFPS. La ARN polimerasa del bacteriófago T7, conocida por su alta procesividad, se emplea predominantemente para la transcripción, aunque también se han utilizado otras polimerasas como la SP6²⁹. La ARN polimerasa endógena de E. coli ha sido adaptada para la creación de prototipos de circuitos genéticos aprovechando los factores sigma³⁰. Por último, se han optimizado sistemáticamente una variedad de precursores de energía 31,32,33 y diferentes sales y componentes tampón 19,34,35 para mejorar la productividad.

Además del propio sistema CFPS, los métodos de encapsulación y los materiales de compartimentación también son vitales para el éxito del ensamblaje de células sintéticas. Varios sistemas que se han desarrollado para encapsular con éxito la reacción CFPS incluyen gotas de agua/aceite estabilizadas con surfactante, lípidos/polímeros y sus vesículas unilaminares híbridas (con diámetros que van desde 50 nm hasta varios μm), así como bicapas lipídicas soportadas planas. Sin embargo, debido al contenido de moléculas complejadas del sistema CFPS, la tasa de éxito de la encapsulación depende de casos específicos, particularmente para la formación de vesículas. Para mejorar la tasa de éxito y la eficiencia de la encapsulación de CFPS, se han desarrollado varios chips de microfluidos para facilitar la formación de gotas y vesículas³⁶. Sin embargo, será necesario establecer chips y dispositivos adicionales.

Este protocolo delinea un sistema CFPS de E. coli que utiliza la cepa BL21 (DE3), que es un huésped comúnmente empleado para la producción de proteínas recombinantes. El protocolo abarca una descripción detallada de la preparación del extracto celular, la preparación de la plantilla y la optimización de la expresión estándar utilizando una proteína reportera fluorescente. Además, presentamos resultados ejemplares logrados al encapsular el sistema CFPS dentro de diversos microcompartimentos, incluidas gotas monocapa, vesículas de emulsión doble y cámaras situadas sobre bicapas lipídicas soportadas. Por último, exponemos los elementos procedimentales fundamentales y las condiciones necesarias indispensables para el establecimiento exitoso de estos sistemas de PPC en contextos ambientales distintos.