合成細胞を構築するための無細胞タンパク質合成システム

合成細胞または人工細胞の合成は、学際的研究の非常に著名な分野として浮上しており、合成生物学、化学、生物物理学の領域全体の科学者から大きな関心を集めています。これらの科学者は、最小の生細胞^1,2,3を構築するという共通の目標によって団結しています。この分野の急速な成長は、組換えDNA操作⁴、生体模倣材料⁵、無細胞タンパク質合成(CFPS)法⁷を含むコンパートメント化のための微細加工技術⁶などの重要な技術の大幅な進歩と歩調を合わせています。CFPSシステムは、転写と翻訳に不可欠な細胞機構を包含し、多機能人工細胞の開発と統合のための基本的なフレームワークを提供します。

CFPS技術は合成細胞のアセンブルに頻繁に使用されますが、さまざまな合成細胞システムのアセンブル化のための堅牢でカスタマイズされたCFPSシステムの開発は依然として複雑な課題です。現在、原核生物と真核生物の両方のモデル生物⁸に由来する多数のCFPSシステムが利用可能であり、それぞれが合成細胞合成の特定のアプリケーションに特化したものである。CFPSシステムは、転写と翻訳における中心的な役割を超えて、その主要なコンポーネントと関連する準備手順が異なります。細胞抽出物、RNAポリメラーゼ、テンプレート調製方法、バッファー組成の違いなど、これらのバリエーションは、主に、タンパク質収量を最大化するためにシステムを集中的に最適化した研究グループが追求する明確な開発軌道によるものです。

CFPSシステムのさまざまなコンポーネントの中で、細胞抽出物は転写と翻訳のための重要な酵素プールであり、したがってCFPSパフォーマンスの重要な決定要因です⁹。大腸菌(大腸菌)ベースのCFPSは、最もよく理解されている原核生物としての地位により、最も一般的に利用されているシステムです。さらに、上田氏の研究グループは、個別に精製されたタンパク質とリボソームからなる完全再構成CFPSシステム「PURE¹⁰」を開発しており、特に明確なバックグラウンドを必要とするアプリケーションに適しています。今日、大腸菌ベースのCFPSシステムでさえ、特にextracのソース株¹¹と調製方法^12,13、RNAポリメラーゼ^14,15、エネルギー源^16,17、および緩衝システム^18,19の点で多様化しています。最も頻繁に使用される株には、A19²⁰、JM109²¹、BL21 (DE3)²²、Rossetta2²³などのK12およびB株の派生株と、それらの遺伝子組換え株が含まれます。

最初に、RNaseおよびプロテアーゼ活性が低下した 大腸菌 株が選択され、mRNAの安定性と新たに合成された組換えタンパク質の安定性が向上し、最終タンパク質収量が増加しました²⁴。続いて、 大腸菌 抽出物は、上記の翻訳後修飾を達成するために、グリコシル化²⁵、リン酸化²⁶、および脂質化²⁷を含む特定の翻訳後修飾を促進するように操作されました。さらに、分子シャペロン²⁸ や化学安定剤などの一連の添加剤が組み込まれており、標的タンパク質の折り畳みを助け、CFPSシステムの多様化に貢献しています。バクテリオファージT7 RNAポリメラーゼは、その高い処理能力で知られており、主に転写に使用されていますが、SP6²⁹ などの他のポリメラーゼも利用されています。 大腸菌 内在性RNAポリメラーゼは、シグマ因子³⁰を活用した遺伝子回路のプロトタイピングに適応しています。最後に、様々なエネルギー前駆体^31、32、33 、および異なる塩および緩衝成分^19、34、35 が、生産性を向上させるために体系的に最適化されている。

CFPSシステム自体に加えて、カプセル化方法とコンパートメント化材料も、合成細胞の組み立てを成功させるために不可欠です。CFPS反応をうまくカプセル化するために開発されたさまざまなシステムには、界面活性剤で安定化された水滴/油滴、脂質/ポリマー、およびそれらのハイブリッド単層小胞(直径50 nmから数μmの範囲)、および平面支持脂質二重膜が含まれます。しかし、CFPSシステムの複合体分子含有量により、カプセル化の成功率は特定のケース、特に小胞の形成に依存します。CFPSのカプセル化の成功率および効率を改善するために、液滴および小胞³⁶の両方の形成を促進するための種々のマイクロ流体チップが開発されてきた。それにもかかわらず、追加のチップとデバイスを確立する必要があります。

このプロトコルは、組換えタンパク質生産に一般的に使用される宿主であるBL21(DE3)株を利用した 大腸菌 CFPSシステムを示しています。このプロトコールには、細胞抽出物の調製、テンプレートの調製、および蛍光レポータータンパク質を使用した標準発現の最適化の詳細な説明が含まれています。さらに、CFPSシステムを、単層液滴、ダブルエマルジョンベシクル、支持脂質二重層の上にあるチャンバーなど、さまざまなマイクロコンパートメント内にカプセル化することによって達成される例示的な結果を示します。最後に、これらのCFPSシステムを異なる環境状況で成功裏に確立するために不可欠な重要な手続き要素と必要条件について詳しく説明します。