Zebrabalığı Embriyolarında Situ Hibridizasyon ve IPSC-EC'lerde Tüp Oluşumu Nda Endoglin'in Vasküler Gelişimdeki Rolünü İncelemek İçin Tam Montaj
Summary
Burada sunulan zebra balığı ve tüp oluşumu tahlil de hasta kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı endotel hücrelerinde tam montaj in situ RNA hibridizasyon analizi için bir protokol vasküler oluşumunda endoglin rolünü incelemektir.
Abstract
Vasküler gelişim, zebra balıklarında farklı gelişim evrelerinde yerinde hibridizasyon tahlilleri ile çalışılabilen spesifik genlerin sıralı ekspresyonu ile belirlenir. Kalıtsal hemorajik telanjiektazi (HHT) gelişimi sırasında damar oluşumunda endoglin(eng) rolünü araştırmak için, zebra balığında eng’in morfolino aracılı hedefli nakavtı, temporal ekspresyonunu ve ilişkili işlevleri incelemek için kullanılır. Burada, tüm-montaj in situ RNA hibridizasyon (WISH) zebrabalığı embriyolarında eng ve downstream genlerinin analizi için istihdam edilmektedir. Ayrıca HHT hasta kaynaklı indüklenen pluripotent kök hücre-diferansiye edici endotel hücrelerinde (iPSC-ECs; eng mutasyonları ile) tüp oluşumu tahlilleri yapılmaktadır. Situ Hybridization tüm miktarı kullanarak belirli bir sinyal yükseltici sistemi – WISH geleneksel yöntemlere göre daha yüksek çözünürlük ve daha düşük arka plan sonuçları sağlar. Daha iyi bir sinyal elde etmek için, fiksasyon sonrası zaman prob hibridizasyon sonra 30 dk ayarlanır. Floresan boyama zebra balığı embriyolarında hassas olmadığından, burada diaminobezidin (DAB) boyama ile değiştirilir. Bu protokolde eng mutasyonu içeren HHT hasta kaynaklı iPSC çizgileri endotel hücrelerine ayrılır. Bir tabla37 °C’de 30 dk bodrum membran matrisi ile kaplandıktan sonra, iPSC-EC’ler tek kat olarak kuyulara seriolarak ekilir ve 37 °C’de 3 saat bekletilir. Daha sonra, tüp uzunluğu ve dalları sayısı mikroskobik görüntüler kullanılarak hesaplanır. Böylece, bu geliştirilmiş WISH protokolü ile, azaltılmış eng ekspresyonu zebrabalığı embriyolarında endotel döl oluşumunu etkilediği gösterilmiştir. Bu daha fazla HHT olan bir hastadan elde edilen iPSC-ECs kullanılarak tüp oluşumu tahlilleri ile doğrulanır. Bu tahliller erken vasküler gelişimde eng için rol onaylamak.
Introduction
HHT’li hastalarda eng (CD105) üzerinde tek bir mutasyon bildirilmiştir. Mutasyon artmış EC proliferasyonu ve azaltılmış akış aracılı EC uzaması yol açar1,2. Ayrıca daha önce ENG eksikliği zebrabalığı3endotel belirteçleri ekspresyonu (yani, kdrl, cdh5, hey2) azaltır bildirilmiştir . Endoglin,özellikle endotel hücrelerinde ifade, bir transmembran glikoprotein ve büyüme faktörü β dönüştürmek için bir ko-reseptör olarak işlevleri (TGF-β) aile üyeleri. Döl1 ekspresyonu da dahil olmak üzere, kök hücre farklılaşmasını sağlamak için hücre yüzeyine BMP9 bağlanmasını yönlendirir4. Bu nedenle eng geni vaskülogenez ve insan damar hastalıklarında önemli rol oynar5,6. Daha önce zebra balığı embriyolarında damar oluşumu üzerinde endoglin knockdown etkilerini inceledik, bir eng mutasyonutaşıyan bir HHT hastadan edinilen iPSCs türetilmiş ECs analizi izledi 7 . Bu protokol, ENG eksikliğinin in vitro anjiyogenezi ölçmek için ölçülebilir bir yöntem olan endotel atası belirteç ekspresyonu ve tüp oluşumu üzerine etkilerini göstermektedir.
Eng mekansal ve zamansal ekspresyonu incelemek için WISH in vivo8’degen ekspresyonunu saptamak için kullanılır. In situ hibridizasyon (ISH), hedef nükleik asit melezlerini sabit bir numunede tespit etmek ve görselleştirmek için hedef nükleik asit (DNA veya mRNA) dizilerini tamamlayan etiketli probların kullanılması yöntemidir. Bu süreç in vivo gen ekspresyonu sinyallerini güçlendirir ve genlerin mikroskopi ile ekspresyonunu saptamak için kullanılır. WISH yaygın olarak çeşitli model hayvanlarda, özellikle zebra balığı9kullanılmıştır. Ayrıca aşağıdaki verileri elde etmek için kullanılır: 1) gen fonksiyonu ve sınıflandırma hakkında bilgi sağlayan gen mekansal/zamansal ifade desenleri; ve 2) özellikle yüksek iş yapımı ilaç veya mutant tarama10kullanılan gen belirteçleri ifade .
Kromojenik problar, yüksek arka plan gürültüsü ve nonspesifik sinyallerle sonuçlanan situ hibridizasyonda (CISH) geleneksel kromozom ile kolayca bozulur11,12. WISH yöntemi, RNA dizilerini hedeflemek için hibridize etmek üzere tasarlanmış iki bağımsız çift Z probkullanır. Her sonda hedef RNA tamamlayıcı bir 18-25 dizisi ve 14 baz kuyruk dizisi (Z olarak kavramsallaştırılmış) içerir. Hedef problar bir çift (çift Z) kullanılır. İki kuyruk dizisi, amplifikatör için 20 bağlama alanı içeren preamplifikatör için 28 baz hibridizasyon alanı oluşturur. Amplifikatör, sırayla, etiket sondası için 20 bağlama sitesi içerir ve teorik olarak her hedef RNA dizisi için 8.000’e kadar etiket verebilir.
Bu ileri teknoloji doku morfolojisi korurken tek moleküllü görselleştirme elde etmek için eşzamanlı sinyal amplifikasyon ve arka plan bastırma kolaylaştırır13. WISH yöntemlerinin daha fazla değişiklik önceki araştırma dayanmaktadır14, ekstra fiksasyon ve DAB boyama dahil. Burada sağlanan hedef RNA kısmen azalmış veya bozulmuş olsa bile çalışabilirsiniz geliştirilmiş bir WISH protokolüdür. Avantajları rnase içermeyen koşullar olmadan 24 saat içinde tamamlanabilir içerir. Sinyaller aynı anda birden fazla hedeften birden fazla kanal üzerinden algılanabilir ve sonuçlar tutarlı dır ve farklı yüksek iş hacmi otomasyon platformlarından elde edilen sonuçlarla uyumludur.
Hayvan modellerinden elde edilen sonuçlar, insanlarda meydana gelen aynı fenomeni yansıtmaya gerek yoktur. ENG, yetim bölgelerde disülfür köprüleri oluşturan c30-C207 ve C53-C182 olmak üzere iki çift korunmuş sistein içerir. HHT hastalarında eng’in rolünü daha fazla incelemek için, HHT hastalarından elde edilen iPSC’li tüp oluşumu tahlilleri eng mutasyonu olmayan hücrelerde gerçekleştirilmiştir (Cys30Arg, C30R)15. Kubota ve ark. ilk tüp oluşumu deney16rapor sonra, töz çeşitli şekillerde geliştirilmiştir. Anjiyojenik veya antianjiogenik faktörleri tanımlamak, anjiyogenezde sinyal yollarını tanımlamak ve anjiyogenezi düzenleyen genleri tanımlamak için kullanılmıştır17.
Önce hasta kaynaklı iPSC-ECs durumu, araştırmacılar anjiyojensis16çalışma için öncelikle kültürlü ECs kullanılır. Ancak, endotel hücreleri için, bir virüs ile eksojen genler transduce için teknik bir meydan okumadır, ECs geçirebilir sınırlı geçiş numarası nedeniyle. Bunun nedeni, insan damarlarından ameliyat veya eşleşen onaylı donörlerden toplanacak kadar hücresel malzeme nin olmamasıdır. Shinya Yamanaka tarafından iPSC üretim tekniğinin icadı ile, insan ECs iPSCs türetilen in vitro deneylerde güvenilir bir şekilde kullanılabilir, daha önce bildirildiği gibi18.
Sınırlı sayıda ve pasajlar ile viral transekçleri kullanarak sinyal çalışmaları için yeterli olabilir, ama fonksiyonel çalışmalar için, mutant pluripotent kök hücre hatları oluşturmak için daha iyidir, (ya iPSCs veya CRISPER / Cas9 hedefli hESCs), sonra tüp oluşumu tahlilleri kullanmak anjiyogenez çalışmaları için ECs içine ayırt19. Tüp oluşumu mutasyonları taşıyan endotel hücrelerinin işlevini değerlendirmek için kullanılabilir. Bu protokol aynı zamanda kolay, uygun maliyetli ve tekrarlanabilir bir yöntem olan bir μ-slide anjiyogenez plakası üzerinde tüp oluşumunu açıklar.
Aşağıdaki protokol, vasküler formasyonda spesifik genlerin rolünün araştırılması için güvenilir ve sistemik bir yöntem, in vivo ekspresyon deseni ve insan hastalığının modellenmesi için in vitro fonksiyonel nicelleştirme ayrıntıları ile birlikte sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol, bir HHT hastasından elde edilen iPSC-EC’lerde zebra balığı ve tüp oluşumu tahlilleri için geliştirilmiş bir yerinde RNA analiz platformu uygulamıştır. Geleneksel ISH yöntemi ekstra deneysel adımlar ile daha uzun bir deneysel döngü gerektirir. Protokolde, sırasıyla WISH tahlillerinde ve tüp oluşumunda uygulanan HHT’li bir hastadan elde edilen bağımsız çift Z probları ve iPSC’lerin kullanımı gibi önemli iyileştirmeler vardır. Bu iyileştirmeler, geleneksel ISH ile gözlenenlerle k…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Çin kök hücre ulusal anahtar araştırma ve geliştirme programı hibe tarafından desteklendi [hibe numarası 2016YFA0102300 (Jun Yang için)];Çin Doğa Bilimleri Vakfı [hibe numarası 81870051, 81670054 (Jun Yang için)]; CAMS Tıp Bilimleri İnovasyon Fonu (CIFMS) [hibe numarası 2016-I2M-4-003 (Jun Yang için)]; PUMC Youth Found ve Merkez Üniversiteler için Temel Araştırma Fonları [hibe numarası 2017310013 (Fang Zhou için)].
Materials
| µ-Slide Angiogenesis | ibidi | 81506 | Cell culture |
| Amp 1-FL | ACD | SDS 320852 | Signal Amplification |
| Amp 2-FL | ACD | SDS 320853 | Signal Amplification |
| Amp 3-FL | ACD | SDS 320854 | Signal Amplification |
| Amp 4 Alt B-FL | ACD | SDS 320856 | Signal Amplification |
| Corning Matrigel Matrix | Corning | 354234 | Growth factor-reduced Matrigel |
| DEPC | Sigma | D5758 | RNAase-free Water |
| Human Endothelial-SFM | Thermofisher | 11111044 | Cell culture |
| Paraformaldehyde | Sigma | 30525-89-4 | Fixed embryos |
| Paraformaldehyde | Sigma | 30525-89-4 | Fixed Cells |
| Protease K | ACD | SDS 322337 | Digest tissue |
| Sodium Citrate | Sigma | 6132-04-3 | SSCT solution: Wash Buffer |
| VEGF-165 | STEMCELL Technologies | 78073 | Growth factor |
References
- Jin, Y., et al. Endoglin prevents vascular malformation by regulating flow-induced cell migration and specification through VEGFR2 signalling. Nature Cell Biology. 19 (6), 639-652 (2017).
- Sugden, W. W., et al. Endoglin controls blood vessel diameter through endothelial cell shape changes in response to haemodynamic cues. Nature Cell Biology. 19 (6), 653-665 (2017).
- Zhang, D., et al. Endoglin is a conserved regulator of vasculogenesis in zebrafish – implications for hereditary haemorrhagic telangiectasia. Bioscience Reports. 39 (5), (2019).
- Lawera, A., et al. Role of soluble endoglin in BMP9 signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (36), 17800-17808 (2019).
- Gallardo-Vara, E., Tual-Chalot, S., Botella, L. M., Arthur, H. M., Bernabeu, C. Soluble endoglin regulates expression of angiogenesis-related proteins and induction of arteriovenous malformations in a mouse model of hereditary hemorrhagic telangiectasia. Disease Models & Mechanisms. 11 (9), (2019).
- Gomez-Puerto, M. C., et al. Autophagy contributes to BMP type 2 receptor degradation and development of pulmonary arterial hypertension. The Journal of Pathology. 249 (3), 356-367 (2019).
- Kim, S. K., Henen, M. A., Hinck, A. P. Structural biology of betaglycan and endoglin, membrane-bound co-receptors of the TGF-beta family. Experimental Biology and Medicine. 244 (17), 1547-1558 (2019).
- Dakou, E., Vanbekbergen, N., Corradi, S., Kemp, C. R., Leyns, L. Whole-Mount In Situ Hybridization (WISH) Optimized for Gene Expression Analysis in Mouse Embryos and Embryoid Bodies. Methods in Molecular Biology. 1211, 27-40 (2014).
- Xiao, C., Gao, L., Hou, Y., Xu, C., Xiong, J. W. Chromatin-remodelling factor Brg1 regulates myocardial proliferation and regeneration in zebrafish. Nature Communications. 7, 13787 (2016).
- Isogai, S., Horiguchi, M., Weinstein, B. M. The vascular anatomy of the developing zebrafish: an atlas of embryonic and early larval development. 발생학. 230 (2), 278-301 (2001).
- Rosa, F. E., Santos, R. M., Rogatto, S. R., Domingues, M. A. Chromogenic in situ hybridization compared with other approaches to evaluate HER2/neu status in breast carcinomas. Brazilian Journal of Medical Biology Research. 46 (3), 207-216 (2013).
- Hauptmann, G., Lauter, G., Soll, I. Detection and signal amplification in zebrafish RNA FISH. Methods. 98, 50-59 (2016).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. The Journal of Molecular Diagnostics. 14 (1), 22-29 (2012).
- Gross-Thebing, T., Paksa, A., Raz, E. Simultaneous high-resolution detection of multiple transcripts combined with localization of proteins in whole-mount embryos. BMC Biology. 12 (1), 55 (2014).
- Fang, Z., et al. EXPRESS: Autologous correction in patient iPSC-ECs to identify a novel pathogenic mutation of Hereditary Hemorrhagic Telangiectasia. Pulmonary Circulation. , (2019).
- Kubota, Y., Kleinman, H. K., Martin, G. R., Lawley, T. J. Role of laminin and basement membrane in the morphological differentiation of human endothelial cells into capillary-like structures. Journal of Cell Biology. 107 (4), 1589-1598 (1988).
- Clayton, Z. E., et al. Induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells promote angiogenesis and accelerate wound closure in a murine excisional wound healing model. Bioscience Reports. 38 (4), (2018).
- Rufaihah, A. J., et al. Endothelial Cells Derived From Human iPSCS Increase Capillary Density and Improve Perfusion in a Mouse Model of Peripheral Arterial Disease. Arteriosclerosis Thrombosis & Vascular Biology. 31 (11), e72-e79 (2011).
- Musunuru, K., Sheikh, F., Gupta, R. M., Houser, S. R., Wu, J. C. Induced Pluripotent Stem Cells for Cardiovascular Disease Modeling and Precision Medicine: A Scientific Statement From the American Heart Association. Clinical Genomics and Precision Medicine. 11 (1), e000043 (2018).
- Wang, L. Y., et al. Apelin attenuates TGF-β1-induced epithelial to mesenchymal transition via activation of PKC-ε in human renal tubular epithelial cells. Peptides. 96, 44-52 (2017).
- El Hallani, S., et al. Tumor and Endothelial Cell Hybrids Participate in Glioblastoma Vasculature. Biomed Research International. , 1-9 (2014).
- Anderson, C. M., et al. Fully Automated RNAscope In Situ Hybridization Assays for Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Cells and Tissues. Journal of Cellular Biochemistry. 117 (10), 2201-2208 (2016).
- Sun, X., Tan, G., Liew, R. Future challenges for patient-specific induced pluripotent stem cells in cardiovascular medicine. Expert Review of Cardiovascular Therapy. 10 (8), 943-945 (2012).
