iPSC-ICにおけるゼブラフィッシュ胚の全山ハイブリダイゼーションとチューブ形成アッセイは血管開発におけるエンドリンの役割を研究する
Summary
ここで提示されるゼブラフィッシュおよび管形成アッセイにおけるその際の全実装RNAハイブリダイゼーション分析のためのプロトコルは、血管形成におけるエンドグリンの役割を研究する患者由来の誘導多能性幹細胞由来の内皮細胞におけるアッセイである。
Abstract
血管の発達は、特定の遺伝子の逐次的発現によって決定され、異なる発達段階でゼブラフィッシュにおけるその際のハイブリダイゼーションアッセイを行うことで研究することができる。遺伝性出血性血管拡張症(HHT)の発達中の血管形成におけるエンドグリン(eng)の役割を調べるには、ゼブラフィッシュにおけるモルフォリノ媒介型の標的型のトノックダウンを用いて、その時間的発現および関連する機能を研究する。ここで、ゼブラフィッシュ胚におけるengおよびその下流遺伝子の解析には、その領域におけるRNAハイブリダイゼーション(WISH)の全実装が採用されている。また、チューブ形成アッセイは、HHT患者由来の誘導多能性幹細胞分化内皮細胞(iPSC-EC;eng変異を有する)においてeng行われる。イン・シグナ・ハイブリダイゼーションの全量を使用する特定の信号増幅システム – WISHは従来の方法と比較して、より高い解像度と低い背景結果を提供します。より良い信号を得るために、後の固定時間は、プローブハイブリダイゼーション後30分に調整される。蛍光染色はゼブラフィッシュ胚では感受性がないので、ここでジアミノベジジン(DAB)染色に置き換えられます。このプロトコルでは、ENG変異を含むHHT患者由来のiPSCラインが内皮細胞に分化される。37°Cで30分間膜マトリックスをプレートにコーティングした後、iPSC-ICを単層としてウェルに播種し、37°Cで3時間保ちます。次に、管長および分岐数を顕微鏡画像を用いて計算する。従って、この改善されたWISHプロトコルにより、トウゲン発現の低下がゼブラフィッシュ胚における内皮前駆体形成に影響を及ぼすことが示される。これは、HHT患者由来のiPSC-ICを用いたチューブ形成アッセイによってさらに確認される。これらのアッセイは、初期血管発達におけるengの役割を確認する。
Introduction
HHT患者では、ENG(CD105)の単一の突然変異が報告されている。この突然変異は、EC増殖の増加と流動媒介EC伸長の減少を招く11,2である。また、ENG欠乏症はゼブラフィッシュ3の内皮マーカー発現(すなわち、kdrl、cdh5、hey2)を低下hey2させることも以前に報告されている。 kdrl cdh5エンドグリンは、主に内皮細胞に発現し、膜貫通糖タンパク質であり、成長因子β(TGF-β)ファミリーメンバーを変換するための共レセプターとして機能する。これは、BMP9結合を細胞表面に指示して、Id1発現を含む下流遺伝子を調節し、幹細胞分化をECs4に誘導する。従って、eng遺伝子は血管形成およびヒト血管疾患55,66において重要な役割を果たす。我々は、ゼブラフィッシュ胚における血管形成に対するエンドグリンノックダウンの影響を検討し、続いて、ENG突然変異を有するHHT患者から取得したiPSC由来のICの分析を行った7。このプロトコルは、EN欠乏が内皮前駆細胞マーカー発現および管形成に及ぼす影響を示し、これはインビトロ血管新生を測定するための定量化可能な方法である。
空間的および時間的発現を研究するために、WISHは、生体内8において遺伝子発現を検出するために採用される。インサイチュハイブリダイゼーション(ISH)では、標的核酸(DNAまたはmRNA)の補数配列を有する標識プローブを用いて、固定検体中の標的核酸ハイブリッドを検出および可視化する方法である。このプロセスは、生体内の遺伝子発現シグナルを増幅し、顕微鏡による遺伝子の発現を検出するために使用されます。WISHは、特にゼブラフィッシュ9で、様々なモデル動物で広く使用されています。また、次のデータを取得するために使用されます: 1) 遺伝子の空間/時間発現パターン, 遺伝子機能と分類に関する情報を提供します;2)高スループット薬物または変異体スクリーニング10に使用される遺伝子マーカーを特異的に発現させる。
染色原性プローブは、従来の染色体を用いてそのシチュハイブリダイゼーション(CISH)で容易に分解され、高いバックグラウンドノイズと非特異的信号11,12,12を生じる。WISH法は、RNA配列を標的とするようにハイブリダイズするように設計された2つの独立した二重Zプローブを使用します。各プローブには、標的RNAと相補的な18~25個の配列と14個のベーステール配列(Zとして概念化)が含まれています。ターゲットプローブはペア(ダブルZ)で使用されます。2つのテールシーケンスは、アンプ用の20の結合部位を含むプリアンプ用の28ベースのハイブリダイゼーションサイトを形成します。このアンプは、標識プローブ用の20個の結合部位を含み、理論的には各ターゲットRNA配列に対して最大8,000個のラベルを生成できます。
この高度な技術は、組織形態13を維持しながら、単一分子可視化を達成するために同時に信号増幅とバックグラウンド抑制を促進する。WISH法のさらなる修飾は、以前の研究14に基づいており、追加の固定およびDAB染色を含む。ここで提供される改良されたWISHプロトコルは、標的RNAが部分的に減少または分解された場合でも動作することができる。利点はRNase自由条件なしで24時間で完了することができることである。複数のターゲットからの複数のチャネルを通じて同時に信号を検出することができ、結果は一貫しており、異なる高スループットの自動化プラットフォームの結果と互換性があります。
動物モデルの結果は、ヒトで起こるのと同じ現象を反映する必要はない。ENGには、孤児の領域で二硫化橋を形成するC30-C207とC53-C182の2組の保存されたシステインが含まれています。HHT患者におけるengの役割をさらに研究するために、HHT患者由来のiPSCを用いたチューブ形成アッセイは、eng変異を伴わない/またはeng変異を伴わない細胞で行われている(Cys30Arg,C30R)15。Kubotaらが最初にチューブ形成実験16を報告した後、アッセイはいくつかの方法で開発された。血管新生または抗血管新生因子を同定し、血管新生におけるシグナル伝達経路を定義し、血管新生17を調節する遺伝子を同定するために用いられている。
患者由来のiPSC-ICが利用できる前に、研究者は主に培養されたECを使用して血管新生16を研究した。しかし、内皮細胞の場合、ECが受けることができる通過数が限られているため、ウイルスを持つ外因性遺伝子をトランスデュースすることは技術的な課題です。これは、手術または一致した承認されたドナーのいずれかから人間の血管から収集されるのに十分な細胞材料がほとんどないためです。山中信也によるiPSC生成技術の発明により、iPSCに由来するヒトICは、前に報告された18のインビトロ実験で確実に使用することができる。
数と通過が限られたウイルス伝達されたICを使用すると、シグナル伝達研究には十分かもしれませんが、機能研究のためには、変異型多能性幹細胞株(iPSCまたはCRISPER/Cas9標的hESCのいずれか)を生成し、チューブ形成アッセイ19を使用する血管新生研究のためにそれらをECsに区別する方が良い。チューブ形成は、突然変異を有する内皮細胞の機能を評価するために使用することができる。このプロトコルは、簡単で費用対効果が高く、再現可能な方法であるμ-Slide血管新生プレート上のチューブ形成についても説明します。
以下のプロトコルは、血管形成における特定の遺伝子の役割を研究するための信頼性の高い全身的な方法と、生体内発現パターンおよびヒト疾患をモデル化するためのインビトロ機能定量の詳細を提供する。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルは、HHT患者由来のiPSC-IC上でゼブラフィッシュおよびチューブ形成アッセイ用の、その場RNA解析プラットフォームにおける改良型の全実装を適用した。従来のISH法では、実験の余分なステップを伴う実験サイクルが長く必要です。プロトコルは、いくつかの重要な改善、独立した二重ZプローブとIPSCの使用は、それぞれWISHアッセイとチューブ形成に適用されたHHT患者に由来する…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、中国幹細胞の国家主要研究開発プログラムと翻訳研究[助成番号2016YFA0102300(Jun Yangまで)];中国自然科学財団[助成番号81870051、81670054(6月まで))の助成金によって支えられました。CAMS医療イノベーション基金(CIFMS)[助成金番号2016-I2M-4-003(ヤンジュンへ)]。PUMC青年発見と中央大学のための基礎研究資金[助成番号2017310013(牙周へ)]。
Materials
| µ-Slide Angiogenesis | ibidi | 81506 | Cell culture |
| Amp 1-FL | ACD | SDS 320852 | Signal Amplification |
| Amp 2-FL | ACD | SDS 320853 | Signal Amplification |
| Amp 3-FL | ACD | SDS 320854 | Signal Amplification |
| Amp 4 Alt B-FL | ACD | SDS 320856 | Signal Amplification |
| Corning Matrigel Matrix | Corning | 354234 | Growth factor-reduced Matrigel |
| DEPC | Sigma | D5758 | RNAase-free Water |
| Human Endothelial-SFM | Thermofisher | 11111044 | Cell culture |
| Paraformaldehyde | Sigma | 30525-89-4 | Fixed embryos |
| Paraformaldehyde | Sigma | 30525-89-4 | Fixed Cells |
| Protease K | ACD | SDS 322337 | Digest tissue |
| Sodium Citrate | Sigma | 6132-04-3 | SSCT solution: Wash Buffer |
| VEGF-165 | STEMCELL Technologies | 78073 | Growth factor |
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