التهجين الكامل في الموقع في أجنة حمار وحشي وأنبوب تشكيل اساي في iPSC-ECs لدراسة دور Endoglin في التنمية الوعائية
Summary
عرض هنا هو بروتوكول لكامل جبل في الموقع الحمض النووي الريبي تحليل التهجين في حمار وحشي وأنبوب تشكيل القول في المريض المستمدة من الخلايا الجذعية المتعددة القدرات المستمدة من الخلايا الانبوبية لدراسة دور endoglin في تكوين الأوعية الدموية.
Abstract
يتم تحديد تطور الأوعية الدموية من خلال التعبير التسلسلي لجينات محددة ، والتي يمكن دراستها من خلال إجراء معينات التهجين في الموقع في سمك الحمار الوحشي خلال مراحل النمو المختلفة. للتحقيق في دور endoglin (eng) في تكوين الأوعية أثناء تطوير telangiectasia النزفية الوراثية (HHT) ، يتم استخدام الضربة القاضية المستهدفة التي تم التوصل إليها بوساطة مورفولينو من المهندس في سمك الحمار الوحشي لدراسة التعبير الزمني والوظائف المرتبطة بها. هنا، يتم استخدام كامل جبل في الموقع التهجين الحمض النووي الريبي (ويش) لتحليل المهندس وجيناته المصب في أجنة حمار وحشي. أيضا، يتم تنفيذ المقالات تشكيل أنبوب في HHT المستمدة من المرضى المستحثة متعددة القدرات الخلايا الجذعية الخلايا الانبوبية المتمايزة (iPSC-ECs؛ مع الطفرات المهندس). نظام تضخيم إشارة محددة باستخدام كامل المبلغ في التهجين في الموقع – يوفر WISH دقة أعلى ونتائج خلفية أقل مقارنة بالطرق التقليدية. للحصول على إشارة أفضل، يتم ضبط وقت ما بعد التثبيت إلى 30 دقيقة بعد التهجين التحقيق. لأن تلطيخ الفلورليسين ليس حساسًا في أجنة الحمار الوحشي ، يتم استبداله بتلطيخ diaminobezidine (DAB) هنا. في هذا البروتوكول، يتم تمييز خطوط IPSC المشتقة من المرضى HHT التي تحتوي على طفرة في الهندسة في الخلايا الانهوائية. بعد طلاء لوحة مع مصفوفة غشاء الطابق السفلي لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية، يتم زرع iPSC-ECs كطبقة أحادية في الآبار وتبقى عند 37 درجة مئوية لمدة 3 ساعة. ثم يتم حساب طول الأنبوب وعدد الفروع باستخدام الصور المجهرية. وهكذا، مع هذا البروتوكول ويش المحسنة، فمن مبين أن انخفاض التعبير المهندس يؤثر على تكوين السلف النهويلي في أجنة حمار وحشي. وهذا ما تؤكده كذلك المقالات التي تستخدم تشكيل الأنبوب باستخدام iPSC-ECs المشتقة من مريض مصاب بHHT. هذه المقالات تؤكد دور المهندس في التنمية الوعائية في وقت مبكر.
Introduction
وقد تم الإبلاغ عن طفرة واحدة على المهندس (CD105) في المرضى الذين يعانون من HHT. الطفرة يؤدي إلى زيادة انتشار المفوضية الأوروبية والحد من التدفق بوساطة EC الإطالة1,2. كما تم الإبلاغ سابقا أن نقص ENG يقلل من التعبير علامات الانثيلية (أي kdrl، cdh5، hey2)في حمار وحشي3. إندوغلين، وأعرب أساسا في الخلايا البطانة ، هو بروتين الجليكوبروتين عبر الغشاء ويعمل كمستقبلات المشاركة لتحويل عامل النمو α (TGF-α) أفراد الأسرة. وهو يوجه BMP9 ملزمة على سطح الخلية لتنظيم الجين المصب، بما في ذلك التعبير Id1، للحث على تمايز الخلايا الجذعية نحو ECs4. وهكذا، فإن الجين المهندس يلعب أدوارا هامة في تكوين الأوعية الدموية وأمراض الأوعية الدموية البشرية5,6. لقد درسنا في السابق آثار الضربة القاضية endoglin على تكوين السفينة في أجنة حمار وحشي ، تليها تحليل ECs المشتقة من iPSCs المكتسبة من مريض HHT تحمل طفرة المهندس 7. يوضح هذا البروتوكول آثار نقص ENG على تعبير علامة السلف البطاني وتكوين الأنبوب ، وهو طريقة قابلة للقياس الكمي للقياس في تولد الأوعية في المختبر.
لدراسة التعبير المكانية والزمنية ، يتم توظيف WISH للكشف عن التعبير الجيني في الجسم الحي8. في التهجين في الموقع (ISH) هو وسيلة لاستخدام المسابير المسمى مع تسلسل تكملة من الأحماض النووية المستهدفة (الحمض النووي أو مرنا) للكشف عن وتصور الهجينة الحمض النووي الهدف في عينة ثابتة. تعمل العملية على تضخيم إشارات التعبير الجيني في الجسم الحي وتستخدم للكشف عن تعبير الجينات عن طريق المجهر. وقد تم استخدام ويش على نطاق واسع في مختلف الحيوانات نموذج, خاصة في حمار وحشي9. كما أنها تستخدم للحصول على البيانات التالية: 1) أنماط التعبير المكاني/الزماني الجينية، التي توفر معلومات عن وظيفة الجينات وتصنيفها؛ (2) أنماط التعبير المكاني/الزمني، التي توفر معلومات عن وظيفة الجينات وتصنيفها؛ (2) أنماط التعبير المكاني/الزمني، التي توفر معلومات عن وظيفة الجينات وتصنيفها؛ (2) أنماط التعبير المكاني/الزمني، التي توفر معلومات عن وظيفة الجينات وتصنيفها؛ (2) أنماط التعبير المكاني و 2) أعرب على وجه التحديد علامات الجينات التي تستخدم في المخدرات عالية الإنتاجية أو الكشف متحولة10.
يتم تدهور المجسات الكروموجينية بسهولة مع الكروموسوم التقليدي في التهجين في الموقع (CISH) ، مما يؤدي إلى ضوضاء خلفية عالية وإشارات غير محددة11،12. تستخدم طريقة WISH مسبارين مستقلين مزدوجين من Z، تم تصميمهما للتهجين لاستهداف تسلسلات الحمض النووي الريبي. يحتوي كل مسبار على تسلسل 18-25 مكملًا للRNA المستهدف وتسلسل ذيل أساسي 14 (تصور يُنظر إليه على أنه Z). يتم استخدام المسابير المستهدفة في زوج (Z مزدوج). تشكل تسلسلات الذيل معاً موقع تهجين أساسي 28 للمكبر اتّفاً، والذي يحتوي على 20 موقع ربط للمكبر للصوت. مكبر للصوت، بدوره، يحتوي على 20 مواقع ملزمة للتحقيق التسمية ويمكن أن تسفر نظريا ما يصل إلى 8000 تسميات لكل تسلسل الحمض النووي الريبي الهدف.
تسهل هذه التقنية المتقدمة تضخيم الإشارة في وقت واحد وقمع الخلفية لتحقيق التصور أحادي الجزيء مع الحفاظ على مورفولوجيا الأنسجة13. ويستند مزيد من التعديل من أساليب WISH على البحوث السابقة14، بما في ذلك تثبيت اضافية وتلطيخ DAB. المنصوص عليها هنا هو بروتوكول ويش المحسنة التي يمكن أن تعمل حتى لو انخفض جزئيا الجيش الملكي النيبالي الهدف أو المتدهورة. وتشمل المزايا أنه يمكن إكماله في 24 ساعة دون ظروف خالية من RNase. يمكن أيضًا اكتشاف الإشارات في وقت واحد من خلال قنوات متعددة من أهداف متعددة ، وتكون النتائج متسقة ومتوافقة مع النتائج من منصات أتمتة عالية الإنتاجية مختلفة.
النتائج من النماذج الحيوانية لا تعكس الضرورية نفس الظاهرة التي تحدث في البشر. ENG يحتوي على اثنين من أزواج من السيستينات المحفوظة، C30-C207 و C53-C182، والتي تشكل جسور الكبريتيد في المناطق اليتيمة. لمزيد من الدراسة دور المهندس في المرضى HHT، وقد أجريت المقالات تشكيل أنبوب مع iPSCs المستمدة من المرضى HHT في خلايا دون / مع الطفرات المهندس (Cys30Arg، C30R)15. بعد أن أبلغ كوبوتا وآخرون لأول مرة عن تجربة تشكيل الأنبوب16، تم تطوير السب في عدة طرق. وقد استخدم لتحديد العوامل الوعائية أو المضادة للأنجيوجيوجينية، وتحديد مسارات الإشارات في تولد الأوعية، وتحديد الجينات التي تنظم تولد الأوعية17.
قبل توافر iPSC-ECs المشتقة من المريض، استخدم الباحثون في المقام الأول ECs المستزرعة لدراسة الانجيوجينز16. ومع ذلك ، بالنسبة للخلايا الداخلية ، فإنه يشكل تحديًا تقنيًا للجينات الخارجية العابرة مع الفيروس ، بسبب عدد المرور المحدود الذي يمكن أن تخضع له ECs. وذلك لأنه لا يكاد يكون هناك ما يكفي من المواد الخلوية التي يمكن جمعها من الأوعية البشرية إما من الجراحة أو المتبرعين المعتمدين المتطابقة. مع اختراع تقنية توليد iPSC من قبل شينيا ياماناكا ، يمكن استخدام ECs البشرية المشتقة من iPSCs بشكل موثوق في التجارب المختبرية ، كما ورد سابقًا18.
باستخدام ECs المستحثة فيروسيا مع أعداد محدودة والممرات قد تكون كافية لدراسات الإشارات, ولكن بالنسبة للدراسات الوظيفية, فمن الأفضل لتوليد خطوط الخلايا الجذعية متعددة القدرات متحولة, (إما iPSCs أو كريسبر / Cas9-المستهدفة hESCs), ثم تمييزها في ECs لدراسات تولد الأوعية التي تستخدم تشكيل أنبوب المقالات19. يمكن استخدام تشكيل الأنبوب لتقييم وظيفة الخلايا الانبوبية التي تحمل طفرات. يصف هذا البروتوكول أيضًا تكوين الأنبوب على لوحة تولد الأوعية الشرائح، وهي طريقة سهلة وفعالة من حيث التكلفة وقابلة للاستنساخ.
يوفر البروتوكول أدناه طريقة موثوقة ومنهجية لدراسة دور جينات محددة في تكوين الأوعية الدموية ، إلى جانب تفاصيل في نمط التعبير الحي وفي المختبر الكمي الوظيفي لنمذجة الأمراض البشرية.
Protocol
Representative Results
Discussion
هذا البروتوكول تطبيق تحسين كامل جبل في الموقع RNA منصة تحليل لحمار وحشي وأنابيب تشكيل المقالات على iPSC-ECs المستمدة من مريض HHT. تتطلب طريقة ISH التقليدية دورة تجريبية أطول مع خطوات تجريبية إضافية. البروتوكول لديه بعض التحسينات الهامة، واستخدام مستقلة مزدوجة Z المسابير وiPSCs المستمدة من المريض مع…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعم هذا العمل بمنح من البرنامج الوطني الرئيسي للبحث والتطوير في الصين – الخلايا الجذعية والبحوث الانتقالية [منحة رقم 2016YFA0102300 (إلى جون يانغ)]؛ مؤسسة علوم الطبيعة في الصين [المنحة رقم 81870051، 81670054 (إلى جون يانغ)]؛ صندوق كامس للابتكار للعلوم الطبية (CIFMS) [منحة رقم 2016-I2M-4-003 (إلى جون يانغ)]؛ تم العثور على شباب PUMC وصناديق البحوث الأساسية للجامعات المركزية [منحة رقم 2017310013 (إلى فانغ تشو)].
Materials
| µ-Slide Angiogenesis | ibidi | 81506 | Cell culture |
| Amp 1-FL | ACD | SDS 320852 | Signal Amplification |
| Amp 2-FL | ACD | SDS 320853 | Signal Amplification |
| Amp 3-FL | ACD | SDS 320854 | Signal Amplification |
| Amp 4 Alt B-FL | ACD | SDS 320856 | Signal Amplification |
| Corning Matrigel Matrix | Corning | 354234 | Growth factor-reduced Matrigel |
| DEPC | Sigma | D5758 | RNAase-free Water |
| Human Endothelial-SFM | Thermofisher | 11111044 | Cell culture |
| Paraformaldehyde | Sigma | 30525-89-4 | Fixed embryos |
| Paraformaldehyde | Sigma | 30525-89-4 | Fixed Cells |
| Protease K | ACD | SDS 322337 | Digest tissue |
| Sodium Citrate | Sigma | 6132-04-3 | SSCT solution: Wash Buffer |
| VEGF-165 | STEMCELL Technologies | 78073 | Growth factor |
References
- Jin, Y., et al. Endoglin prevents vascular malformation by regulating flow-induced cell migration and specification through VEGFR2 signalling. Nature Cell Biology. 19 (6), 639-652 (2017).
- Sugden, W. W., et al. Endoglin controls blood vessel diameter through endothelial cell shape changes in response to haemodynamic cues. Nature Cell Biology. 19 (6), 653-665 (2017).
- Zhang, D., et al. Endoglin is a conserved regulator of vasculogenesis in zebrafish – implications for hereditary haemorrhagic telangiectasia. Bioscience Reports. 39 (5), (2019).
- Lawera, A., et al. Role of soluble endoglin in BMP9 signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (36), 17800-17808 (2019).
- Gallardo-Vara, E., Tual-Chalot, S., Botella, L. M., Arthur, H. M., Bernabeu, C. Soluble endoglin regulates expression of angiogenesis-related proteins and induction of arteriovenous malformations in a mouse model of hereditary hemorrhagic telangiectasia. Disease Models & Mechanisms. 11 (9), (2019).
- Gomez-Puerto, M. C., et al. Autophagy contributes to BMP type 2 receptor degradation and development of pulmonary arterial hypertension. The Journal of Pathology. 249 (3), 356-367 (2019).
- Kim, S. K., Henen, M. A., Hinck, A. P. Structural biology of betaglycan and endoglin, membrane-bound co-receptors of the TGF-beta family. Experimental Biology and Medicine. 244 (17), 1547-1558 (2019).
- Dakou, E., Vanbekbergen, N., Corradi, S., Kemp, C. R., Leyns, L. Whole-Mount In Situ Hybridization (WISH) Optimized for Gene Expression Analysis in Mouse Embryos and Embryoid Bodies. Methods in Molecular Biology. 1211, 27-40 (2014).
- Xiao, C., Gao, L., Hou, Y., Xu, C., Xiong, J. W. Chromatin-remodelling factor Brg1 regulates myocardial proliferation and regeneration in zebrafish. Nature Communications. 7, 13787 (2016).
- Isogai, S., Horiguchi, M., Weinstein, B. M. The vascular anatomy of the developing zebrafish: an atlas of embryonic and early larval development. 발생학. 230 (2), 278-301 (2001).
- Rosa, F. E., Santos, R. M., Rogatto, S. R., Domingues, M. A. Chromogenic in situ hybridization compared with other approaches to evaluate HER2/neu status in breast carcinomas. Brazilian Journal of Medical Biology Research. 46 (3), 207-216 (2013).
- Hauptmann, G., Lauter, G., Soll, I. Detection and signal amplification in zebrafish RNA FISH. Methods. 98, 50-59 (2016).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. The Journal of Molecular Diagnostics. 14 (1), 22-29 (2012).
- Gross-Thebing, T., Paksa, A., Raz, E. Simultaneous high-resolution detection of multiple transcripts combined with localization of proteins in whole-mount embryos. BMC Biology. 12 (1), 55 (2014).
- Fang, Z., et al. EXPRESS: Autologous correction in patient iPSC-ECs to identify a novel pathogenic mutation of Hereditary Hemorrhagic Telangiectasia. Pulmonary Circulation. , (2019).
- Kubota, Y., Kleinman, H. K., Martin, G. R., Lawley, T. J. Role of laminin and basement membrane in the morphological differentiation of human endothelial cells into capillary-like structures. Journal of Cell Biology. 107 (4), 1589-1598 (1988).
- Clayton, Z. E., et al. Induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells promote angiogenesis and accelerate wound closure in a murine excisional wound healing model. Bioscience Reports. 38 (4), (2018).
- Rufaihah, A. J., et al. Endothelial Cells Derived From Human iPSCS Increase Capillary Density and Improve Perfusion in a Mouse Model of Peripheral Arterial Disease. Arteriosclerosis Thrombosis & Vascular Biology. 31 (11), e72-e79 (2011).
- Musunuru, K., Sheikh, F., Gupta, R. M., Houser, S. R., Wu, J. C. Induced Pluripotent Stem Cells for Cardiovascular Disease Modeling and Precision Medicine: A Scientific Statement From the American Heart Association. Clinical Genomics and Precision Medicine. 11 (1), e000043 (2018).
- Wang, L. Y., et al. Apelin attenuates TGF-β1-induced epithelial to mesenchymal transition via activation of PKC-ε in human renal tubular epithelial cells. Peptides. 96, 44-52 (2017).
- El Hallani, S., et al. Tumor and Endothelial Cell Hybrids Participate in Glioblastoma Vasculature. Biomed Research International. , 1-9 (2014).
- Anderson, C. M., et al. Fully Automated RNAscope In Situ Hybridization Assays for Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Cells and Tissues. Journal of Cellular Biochemistry. 117 (10), 2201-2208 (2016).
- Sun, X., Tan, G., Liew, R. Future challenges for patient-specific induced pluripotent stem cells in cardiovascular medicine. Expert Review of Cardiovascular Therapy. 10 (8), 943-945 (2012).
