Whole-Mount In Situ Hybridisatie in Zebrafish Embryo's en Tube Formation Assay in iPSC-ECs om de rol van Endoglin in vasculaire ontwikkeling te bestuderen

Een enkele mutatie op eng (CD105) is gemeld bij patiënten met HHT. De mutatie leidt tot een grotere proliferatie van de EG en tot een verminderde doorstroom gemedieerde EG-verlenging^1,2. Het is ook eerder gemeld dat ENG-deficiëntie de expressie van endotheelmarkeringen vermindert (d.w.z. kdrl, cdh5, hey2) bij zebravis³. Endoglin, voornamelijk uitgedrukt in endotheelcellen, is een transmembrane glycoproteïne en functioneert als een co-receptor voor het transformeren van groeifactor β (TGF-β) familieleden. Het stuurt BMP9 binding op het celoppervlak te reguleren downstream gen, met inbegrip van Id1 expressie, om stamcel differentiatie te induceren in de richting van ECs⁴. Zo speelt het eng-gen een belangrijke rol bij vasculogenese en menselijke vasculaire aandoeningen^5,6. We hebben eerder de effecten onderzocht van endoglin knockdown op de vorming van bloedvaten in zebravisembryo’s, gevolgd door een analyse van door iPSCs afgeleide ECs die is verkregen van een HHT-patiënt met een eng-mutatie ⁷. Dit protocol toont de effecten aan van ENG-deficiëntie op endotheelverermarkeringsexpressie en buisvorming, een kwantificeerbare methode voor het meten van in vitro angiogenese.

Om ruimtelijke eng-expressie te bestuderen, wordt WISH gebruikt om genexpressie in vivo⁸te detecteren. In situ hybridisatie (ISH) is een methode voor het gebruik van gelabelde sondes met complementsequenties van doelkernzuren (DNA of mRNA) om doelkernzuurhybriden in een vast monster te detecteren en te visualiseren. Het proces versterkt genexpressiesignalen in vivo en wordt gebruikt om de expressie van genen door microscopie te detecteren. WISH is op grote schaal gebruikt in verschillende modeldieren, vooral in zebravis⁹. Het wordt ook gebruikt om de volgende gegevens te verwerven: 1) gen ruimtelijke / temporele expressie patronen, die informatie over genfunctie en classificatie; en 2) specifiek uitgedrukte genmarkers die worden gebruikt bij high-throughput drug of mutant screening¹⁰.

Chromogene sondes worden gemakkelijk afgebroken met traditionele chromosoom in situ hybridisatie (CISH), wat resulteert in hoge achtergrondgeluid en niet-specifieke signalen^11,12. De WISH-methode maakt gebruik van twee onafhankelijke dubbele Z-sondes, die zijn ontworpen om te hybridiseren om RNA-sequenties te targeten. Elke sonde bevat een 18-25 sequentie complementair aan het doel RNA en een 14 base staart sequentie (geconceptualiseerd als Z). De doelsondes worden gebruikt in een paar (dubbel Z). De twee staartsequenties vormen samen een 28 base hybridisatie site voor de voorversterker, die 20 bindingsplaatsen voor de versterker bevat. De versterker bevat op zijn beurt 20 bindingsplaatsen voor de labelsonde en kan in theorie tot 8.000 labels opleveren voor elke doelRNA-sequentie.

Deze geavanceerde technologie vergemakkelijkt gelijktijdige signaalversterking en achtergrondonderdrukking om visualisatie van één molecuul te bereiken met behoud van weefselmorfologie^13. Verdere wijziging van de WISH-methoden is gebaseerd op eerder onderzoek¹⁴, inclusief extra fixatie en DAB-kleuring. Hier is een verbeterde WISH protocol dat kan werken, zelfs als het doel RNA is gedeeltelijk verlaagd of gedegradeerd. Voordelen zijn onder meer dat het kan worden voltooid in 24 uur zonder RNase-vrije voorwaarden. Signalen kunnen ook gelijktijdig worden gedetecteerd via meerdere kanalen van meerdere doelen, en de resultaten zijn consistent en compatibel met resultaten van verschillende high-throughput automatiseringsplatforms.

Resultaten van diermodellen zijn niet nodig en weerspiegelen hetzelfde fenomeen dat bij de mens voorkomt. ENG bevat twee paren geconserveerde cysteines, C30-C207 en C53-C182, die disulfide bruggen vormen in weesgebieden. Om de rol van eng bij HHT-patiënten verder te bestuderen, zijn buisvormingstesten uitgevoerd met iPSC’s afkomstig van HHT-patiënten in cellen zonder/met engmutaties (Cys30Arg, C30R)¹⁵. Nadat Kubota et al. voor het eerst het buisvormingsexperiment¹⁶rapporteerde, is de test op verschillende manieren ontwikkeld. Het is gebruikt om angiogene of antiangiogene factoren te identificeren, de signaleringstrajecten in angiogenese te definiëren en genen te identificeren die angiogenese¹⁷reguleren.

Voorafgaand aan de beschikbaarheid van door patiënten afgeleide iPSC-IC’s gebruikten onderzoekers voornamelijk gekweekte ECs om angiogensis¹⁶te bestuderen. Voor endotheelcellen is het echter een technische uitdaging om exogene genen met een virus te transduceren, vanwege het beperkte passageaantal dat EC’s kunnen ondergaan. Dit komt omdat er nauwelijks genoeg cellulair materiaal te verzamelen uit menselijke vaten, hetzij uit een operatie of gematched goedgekeurde donoren. Met de uitvinding van de iPSC generatie techniek door Shinya Yamanaka, menselijke ECs afgeleid van iPSCs kan betrouwbaar worden gebruikt in in vitro experimenten, zoals eerder gemeld¹⁸.

Het gebruik van viraal getransduceerde ECs’s met beperkte aantallen en passages kan voldoende zijn voor signaleringsstudies, maar voor functionele studies is het beter om gemuteerde pluripotente stamcellijnen te genereren (iPSCs of CRISPER/Cas9-gerichte hESCs), en ze vervolgens te differentiëren in ECs voor angiogenesestudies die gebruik maken van buisvormingsanalyses¹⁹. Buisvorming kan worden gebruikt om de functie van endotheelcellen met mutaties te evalueren. Dit protocol beschrijft ook buisvorming op een μ-slide angiogeneseplaat, wat een eenvoudige, kosteneffectieve en reproduceerbare methode is.

Het onderstaande protocol biedt een betrouwbare en systemische methode voor het bestuderen van de rol van specifieke genen in vasculaire vorming, samen met details voor in vivo expressiepatroon en in vitro functionele kwantificering voor het modelleren van menselijke ziekten.