Hibridização em Embriões de Zebrafish e Ensaio de Formação de Tubos em iPSC-CEs para estudar o papel da endoglina no desenvolvimento vascular

Uma única mutação no eng (CD105) foi relatada em pacientes com HHT. A mutação leva ao aumento da proliferação da CE e à redução do alongamento da CE mediada pelo fluxo^1,,2. Também foi relatado anteriormente que a deficiência de ENG reduz a expressão de marcadores endoteliais (ou seja, kdrl, cdh5, hey2) em zebrafish³. Endoglin, expressa principalmente em células endoteliais, é uma glicoproteína transmembrana e funciona como um co-receptor para transformar o fator de crescimento β (TGF-β) membros da família. Ele direciona a ligação BMP9 na superfície celular para regular o gene a jusante, incluindo a expressão Id1, para induzir a diferenciação de células-tronco em relação aos CE⁴. Assim, o gene eng desempenha papéis importantes na vasculogênese e na doença vascular humana^5,6. Examinamos anteriormente os efeitos da derrubada de endoglin na formação de vasos em embriões de zebrafish, seguido pela análise de CEs derivados de iPSCs adquiridos de um paciente com HHT com uma mutação eng ⁷. Este protocolo demonstra os efeitos da deficiência de ENG na expressão do marcador progenitor endotelial e na formação de tubos, que é um método quantificável para medir angiogênese in vitro.

Para estudar a expressão espacial e temporal, o WISH é empregado para detectar a expressão genética in vivo⁸. A hibridização in situ (ISH) é um método de uso de sondas rotuladas com sequências complementares de ácidos nucleicos-alvo (DNA ou mRNA) para detectar e visualizar híbridos de ácido nucleico alvo em uma amostra fixa. O processo amplifica sinais de expressão genética in vivo e é usado para detectar a expressão de genes por microscopia. A WISH tem sido amplamente utilizada em vários animais modelo, especialmente em zebrafish⁹. Também é usado para adquirir os seguintes dados: 1) padrões de expressão espacial/temporal genética, que fornecem informações sobre a função e classificação genética; e 2) marcadores genéticos expressos especificamente que são usados em drogas de alta produtividade ou triagem mutante¹⁰.

As sondas cromogênicas são facilmente degradadas com o cromossomo tradicional in situ hibridização (CISH), o que resulta em alto ruído de fundo e sinais inespecíficos^11,12. O método WISH usa duas sondas Z duplas independentes, que são projetadas para hibridizar para atingir sequências de RNA. Cada sonda contém uma sequência de 18-25 complementar ao RNA alvo e uma sequência de cauda base de 14 (conceitualizada como Z). As sondas-alvo são usadas em um par (duplo Z). As duas sequências de cauda juntas formam um local de hibridização de 28 bases para o pré-amplificador, que contém 20 locais de ligação para o amplificador. O amplificador, por sua vez, contém 20 sites de vinculação para a sonda de etiqueta e pode teoricamente render até 8.000 etiquetas para cada sequência de RNA de destino.

Esta tecnologia avançada facilita a amplificação simultânea de sinal e a supressão de fundo para alcançar a visualização de molécula única, preservando a morfologia tecidual¹³. Outra modificação dos métodos WISH baseia-se em pesquisas anteriores¹⁴, incluindo fixação extra e coloração da DAB. Desde aqui está um protocolo WISH melhorado que pode funcionar mesmo que o RNA alvo seja parcialmente diminuído ou degradado. As vantagens incluem que ele pode ser concluído em 24 horas sem condições livres de RNase. Os sinais também podem ser detectados simultaneamente através de vários canais de vários alvos, e os resultados são consistentes e compatíveis com resultados de diferentes plataformas de automação de alto rendimento.

Os resultados de modelos animais não refletem o mesmo fenômeno que ocorre em humanos. A ENG contém dois pares de cisteínas conservadas, C30-C207 e C53-C182, que formam pontes de dissulfeto em regiões órfãs. Para estudar melhor o papel do eng em pacientes com HHT, ensaios de formação de tubos com iPSCs derivados de pacientes com HHT têm sido realizados em células sem/com mutações eng (Cys30Arg, C30R)¹⁵. Depois que Kubota et al. relataram pela primeira vez o experimento de formação de^{tubos 16,}o ensaio foi desenvolvido de várias maneiras. Tem sido usado para identificar fatores angiogênicos ou antiangiogênicos, definir as vias de sinalização na angiogênese e identificar genes que regulam a angiogênese¹⁷.

Antes da disponibilidade de iPSC-CE derivados do paciente, os pesquisadores usavam eCs principalmente cultos para estudar angiogense¹⁶. No entanto, para as células endoteliais, é um desafio técnico transduir genes exógenos com um vírus, devido ao número de passagem limitado que as CEs podem sofrer. Isso porque não há material celular suficiente para ser coletado de vasos humanos, seja de cirurgia ou doadores aprovados. Com a invenção da técnica de geração iPSC por Shinya Yamanaka, os CEs humanos derivados de iPSCs podem ser usados de forma confiável em experimentos in vitro, como relatado anteriormente¹⁸.

O uso de CEs transduzidas viralmente com números e passagens limitadas pode ser suficiente para estudos de sinalização, mas para estudos funcionais, é melhor gerar linhas de células-tronco pluripotentes mutantes, (iPSCs ou hESCs alvo CRISPER/Cas9), em seguida, diferenciá-los em CEs para estudos de angiogênese que usam ensaios de formação de tubos¹⁹. A formação de tubos pode ser usada para avaliar a função das células endoteliais que carregam mutações. Este protocolo também descreve a formação de tubos em uma placa de angiogênese de μ-slide, que é um método fácil, econômico e reprodutível.

O protocolo abaixo fornece um método confiável e sistêmico para estudar o papel de genes específicos na formação vascular, juntamente com detalhes para o padrão de expressão in vivo e quantificação funcional in vitro para modelagem de doenças humanas.