혈관 발달에서 엔도글린의 역할을 연구하기 위해 iPSC-ECs의 제브라피시 배아 및 튜브 형성 분석에서 시투 혼성화에 대한 전체 마운트
Summary
여기서 제시된 것은 혈관 형성에서 엔도글린의 역할을 연구하기 위해 환자 유래 유도 만능 줄기 세포 유래 내피 세포에서 제브라피쉬 및 튜브 형성 분석에서 의 제브라피시 및 튜브 형성 분석에서 전체 마운트에 대한 프로토콜이다.
Abstract
혈관 발달은 특정 유전자의 순차적 발현에 의해 결정되며, 이는 상이한 발달 단계 동안 제브라피시의 실화 혼성 분석실험에서 수행함으로써 연구될 수 있다. 유전 출혈성 모두랑성 말단확장증 (HHT)의 발달 도중 혈관 형성에 있는 endoglin (eng)의 역할을 조사하기 위하여는, zebrafish에 있는 eng의 모르폴리노 중재한 표적 녹다운은 그것의 측두식 및 관련 기능을 공부하기 위하여 이용됩니다. 여기서, 제브라피시 배아에서 의 eng 및 그 하류 유전자의 분석을 위해 위시(WISH)의 전체 마운트가 채용된다. 또한, 튜브 형성 은 HHT 환자 유래 유도 만능 줄기 세포 에서 수행 -분화 내피 세포 (iPSC-ECs; eng 돌연변이와 함께). 전체 양을 사용하는 특정 신호 증폭 시스템 인 시투 하이브리드화 – WISH는 기존 방법에 비해 더 높은 해상도와 낮은 배경 결과를 제공합니다. 더 나은 신호를 얻기 위해, 포스트 픽스레이션 시간은 프로브 혼성화 후 30분으로 조정된다. 형광 염색은 제브라피시 배아에 민감하지 않기 때문에, 여기에서 염색하는 디아미노베지딘(DAB)으로 대체된다. 이 프로토콜에서, eng 돌연변이를 포함하는 HHT 환자 유래 iPSC 라인은 내피 세포로 분화된다. 37°C에서 30분 동안 지하 멤브레인 매트릭스로 플레이트를 코팅한 후, iPSC-EC는 웰내로 단층으로 시드되고 3시간 동안 37°C에서 유지된다. 그런 다음, 튜브 길이와 가지의 수는 현미경 이미지를 사용하여 계산된다. 따라서, 이러한 개선된 WISH 프로토콜을 통해, 감소된 eng 발현이 제브라피시 배아에서 내피 전구 형성에 영향을 미친다는 것을 알 수 있다. 이것은 HHT를 가진 환자에게서 파생된 iPSC-EC를 사용하여 관 대형 검역에 의해 추가확인됩니다. 이러한 해약은 초기 혈관 발달에서 eng에 대한 역할을 확인한다.
Introduction
eng (CD105)에 단 하나 돌연변이는 HHT를 가진 환자에서 보고되었습니다. 돌연변이는 증가된 EC 증식 및 감소된 유동 매개 EC 신장1,,2로이어집니다. 또한 이전에 는 ENG 결핍이 제브라피시3에서내피 마커 발현(즉, kdrl, cdh5, hey2)을감소시킨다고 보고되었다. Endoglin,주로 내피 세포에서 발현, 막 막 당단백질 및 성장 인자 β (TGF-β) 가족 구성원을 변형시키기위한 공동 수용체로서의 기능. 그것은 ECs 4를향해 줄기 세포 분화를 유도하기 위하여 Id1 발현을 포함하여 다운스트림 유전자를 통제하기 위하여 세포 표면에 BMP9 결합을 지시합니다. 따라서, eng 유전자는 혈관 발생 및 인간 혈관 질환5,,6에서중요한 역할을 한다. 우리는 이전에 eng 돌연변이를 품고 HHT 환자에게서 취득한 iPSCs 파생된 ECs의 분석에 선행된 zebrafish 태아에 있는 혈관 대형에 endoglin 녹다운의 효력을 검토했습니다7. 이 프로토콜은 내피 전구 마커 발현 및 튜브 형성에 대한 ENG 결핍의 효과를 보여 주며, 이는 시험관 내 혈관신생을 측정하기 위한 정량화 가능한 방법이다.
eng 공간 및 시간발현을 연구하기 위해, WISH는 생체 내 유전자 발현을 검출하기 위해 사용된다8. 상기 소성형화(ISH)는 고정된 시편에서 표적 핵산 하이브리드를 검출하고 시각화하기 위해 표적 핵산(DNA 또는 mRNA)의 보체 서열을 가진 표지된 프로브를 사용하는 방법이다. 이 과정은 생체 내에서 유전자 발현 신호를 증폭시키고 현미경 검사법에 의한 유전자의 발현을 감지하는 데 사용됩니다. WISH는 다양한 모델 동물, 특히 제브라피시9에서널리 사용되어 왔습니다. 그것은 또한 다음 데이터를 취득 하는 데 사용 됩니다.: 1) 유전자 기능 및 분류에 대 한 정보를 제공 하는 유전자 공간/시간 발현 패턴; 및 2) 고처리량 약물 또는 돌연변이 스크리닝에 사용되는 구체적으로 발현된 유전자마커(10).
발색성 프로브는 높은 배경 잡음 및 비특이적 신호11,,12의결과로 SITU 혼성화 (CISH)에서 전통적인 염색체로 쉽게 분해됩니다. WISH 방법은 두 개의 독립적인 이중 Z 프로브를 사용하며, 이는 표적 RNA 서열을 혼성화하도록 설계되었습니다. 각 프로브는 표적 RNA 및 14염기 꼬리 서열에 상보적인 18-25 서열을 함유한다(Z로 개념화). 대상 프로브는 쌍(이중 Z)으로 사용됩니다. 두 개의 테일 서퀀스는 함께 증폭기용 20개의 결합 부위를 포함하는 프리앰프에 대한 28개의 염기 혼성화 사이트를 형성한다. 증폭기는 차례로, 라벨 프로브를 위한 20개의 결합 사이트를 포함하고 이론적으로 각 표적 RNA 순서를 위한 8,000개의 레이블까지 산출할 수 있습니다.
이 첨단 기술은 조직 형태(13)를보존하면서 단일 분자 시각화를 달성하기 위해 동시 신호 증폭 및 배경 억제를 용이하게합니다. WISH 방법의 추가 수정은 추가 고정 및 DAB 염색을 포함하여 이전 연구14를기반으로합니다. 여기서 제공되는 표적 RNA가 부분적으로 감소되거나 저하되더라도 작동할 수 있는 개선된 WISH 프로토콜이 있다. 장점은 RNase없는 조건없이 24 시간에서 완료 할 수 있다는 것을 포함한다. 또한 여러 대상의 여러 채널을 통해 신호를 동시에 감지할 수 있으며, 그 결과는 서로 다른 고처리량 자동화 플랫폼의 결과와 일관되고 호환됩니다.
동물 모델의 결과는 인간에서 발생하는 동일한 현상을 반영할 필요가 없습니다. ENG에는 고아 지역에서 이황화물 다리를 형성하는 보존 된 시스테인, C30-C207 및 C53-C182 쌍이 포함되어 있습니다. HHT 환자에서 eng의 역할을 추가로 연구하기 위해, HHT 환자로부터 유래된 iPSCs를 가진 관 형성 성 세포는 eng 돌연변이가 없는 세포에서 수행되었다(Cys30Arg, C30R)15. Kubota 외. 먼저 튜브 형성 실험16을보고 한 후, 분석실험은 여러 가지 방법으로 개발되었다. 혈관신생 또는 항혈관신생 인자를 식별하고, 혈관신생에서 신호 경로를 정의하고, 혈관신생을 조절하는 유전자를 식별하는 데 사용되어 왔다17.
환자 유래 iPSC-EC의 가용성 이전에, 연구원은 혈관 신생을 연구하기 위하여 주로 배양된 EC를이용했습니다 16. 그러나, 내피 세포의 경우, IC가 겪을 수있는 제한된 통로 수 때문에 바이러스로 외인성 유전자를 변환하는 것은 기술적 인 도전입니다. 이것은 수술 또는 일치하는 승인된 기증자에서 인간 적인 혈관에서 집합될 거의 충분한 세포 물질이 없기 때문입니다. 야마나카 신야에 의한 iPSC 생성 기술의 발명으로, iPSCs로부터 유래된 인간 ECs는 시험관 내 실험에서 안정적으로 사용될 수 있다고18일이전에 보고된 바와 같이.
제한된 수와 통로를 가진 바이러스성 으로 변환된 ECs를 사용하는 것은 신호 연구 결과를 위해 충분할지도 모르지만, 기능적인 연구 결과를 위해, 돌연변이 다능성 줄기 세포주(iPSCs 또는 CRISPER/Cas9 표적 hESCs)를 생성하는 것이 좋습니다, 그 다음 관 형성 분석제19를사용하는 혈관 신생 연구를 위해 ECs로 분화. 관 형성은 돌연변이를 베어링 내피 세포의 기능을 평가하기 위해 사용될 수있다. 이 프로토콜은 또한 쉽고 비용 효율적이며 재현 가능한 방법인 μ-slide 혈관신생 플레이트에서 튜브 형성을 설명합니다.
아래 프로토콜은 생체 내 발현 패턴 및 인체 질환 모델링을 위한 생체외 기능적 정량화에 대한 세부 사항과 함께 혈관 형성에서 특정 유전자의 역할을 연구하기 위한 신뢰할 수 있고 체계적인 방법을 제공합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 HHT 환자에서 유래된 iPSC-EC에 제브라피시 및 튜브 형성 분석을 위한 situ RNA 분석 플랫폼에서 개선된 전체 마운트를 적용했습니다. 전통적인 ISH 방법은 추가 실험 단계와 더 긴 실험 주기를 필요로한다. 프로토콜은 몇 가지 중요한 개선, 각각 WISH 분석 및 튜브 형성에 적용 된 HHT 환자에서 파생 된 독립적 인 이중 Z 프로브 및 iPSCs의 사용. 이러한 개선은 기존의 ISH에서 관찰되는 것과 비?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 중국 줄기 세포 및 번역 연구의 국가 핵심 연구 개발 프로그램의 보조금에 의해 지원되었다 [보조금 번호 2016YFA0102300 (준 양에)];중국의 자연 과학 재단 [보조금 번호 81870051, 81670054 (준 양)]; 의학을 위한 CAMS 혁신 기금 (CIFMS) [보조금 번호 2016-I2M-4-003 (준 양에)]; PUMC 청소년 발견 및 중앙 대학에 대한 기본 연구 기금 [보조금 번호 2017310013 (팡 저우에)].
Materials
| µ-Slide Angiogenesis | ibidi | 81506 | Cell culture |
| Amp 1-FL | ACD | SDS 320852 | Signal Amplification |
| Amp 2-FL | ACD | SDS 320853 | Signal Amplification |
| Amp 3-FL | ACD | SDS 320854 | Signal Amplification |
| Amp 4 Alt B-FL | ACD | SDS 320856 | Signal Amplification |
| Corning Matrigel Matrix | Corning | 354234 | Growth factor-reduced Matrigel |
| DEPC | Sigma | D5758 | RNAase-free Water |
| Human Endothelial-SFM | Thermofisher | 11111044 | Cell culture |
| Paraformaldehyde | Sigma | 30525-89-4 | Fixed embryos |
| Paraformaldehyde | Sigma | 30525-89-4 | Fixed Cells |
| Protease K | ACD | SDS 322337 | Digest tissue |
| Sodium Citrate | Sigma | 6132-04-3 | SSCT solution: Wash Buffer |
| VEGF-165 | STEMCELL Technologies | 78073 | Growth factor |
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