Hybridation in situ à monture entière chez les embryons de poissons zèbres et l’essai de formation de tubes dans iPSC-ECs pour étudier le rôle de l’Endoglin dans le développement vasculaire

Une mutation simple sur eng (CD105) a été rapportée dans les patients présentant HHT. La mutation conduit à une prolifération accrue de la CE et à une réduction de l’allongement de l’EC négocié par le flux^1,2. Il a également été précédemment signalé que l’insuffisance ENG réduit l’expression des marqueurs endothéliaux (c.-à-d., kdrl, cdh5, hey2) dans le poisson zèbre³. Endoglin, principalement exprimée dans les cellules endothéliales, est une glycoprotéine transmémbrane et fonctionne comme un co-récepteur pour transformer le facteur de croissance (TGF-MD) membres de la famille. Il ordonne bMP9 liaison sur la surface cellulaire pour réguler le gène en aval, y compris l’expression Id1, pour induire la différenciation des cellules souches vers les CE⁴. Ainsi, le gène eng joue des rôles importants dans la vasculogenèse et la maladie vasculaire humaine^5,6. Nous avons déjà examiné les effets de l’endoglin knockdown sur la formation de vaisseaux dans les embryons de poissons zèbres, suivie par l’analyse des CPE dérivés d’iPSC acquis à partir d’un patient HHT portant une mutation eng ⁷. Ce protocole démontre les effets de l’insuffisance d’ENG sur l’expression et la formation de marqueur d’ancêtre endothélial, qui est une méthode quantifiable pour mesurer l’angiogenèse in vitro.

Pour étudier l’expression spatiale et temporelle, WISH est utilisé pour détecter l’expression des gènes in vivo⁸. L’hybridation in situ (ISH) est une méthode d’utilisation de sondes étiquetées avec des séquences complètes d’acides nucléiques cibles (ADN ou ARNM) pour détecter et visualiser les hybrides d’acide nucléique cible dans un spécimen fixe. Le processus amplifie les signaux d’expression génique in vivo et est utilisé pour détecter l’expression des gènes par microscopie. WISH a été largement utilisé dans divers animaux modèles, en particulier dans le poisson zèbre⁹. Il est également utilisé pour acquérir les données suivantes : 1) les modèles d’expression spatiale/temporelle des gènes, qui fournissent des informations sur la fonction et la classification des gènes; et 2) ont expressément exprimé des marqueurs génétiques qui sont utilisés dans le dépistage de drogue ou de mutant à haut débit¹⁰.

Les sondes chromogéniques sont facilement dégradées avec l’hybridation in situ chromosomique traditionnelle (CISH), ce qui entraîne un bruit de fond élevé et des signaux non spécifiques^11,12. La méthode WISH utilise deux sondes doubles Z indépendantes, qui sont conçues pour s’hybrider pour cibler les séquences d’ARN. Chaque sonde contient une séquence de 18-25 complémentaire à l’ARN cible et une séquence de queue de base de 14 (conceptualisée comme Z). Les sondes cibles sont utilisées en paire (double Z). Les deux séquences de queue ensemble forment un site d’hybridation de base de 28 pour le préamplificateur, qui contient 20 sites de liaison pour l’amplificateur. L’amplificateur, à son tour, contient 20 sites de liaison pour la sonde d’étiquette et peut théoriquement donner jusqu’à 8.000 étiquettes pour chaque séquence d’ARN cible.

Cette technologie de pointe facilite l’amplification simultanée du signal et la suppression de fond pour réaliser la visualisation d’une seule molécule tout en préservant la morphologie des tissus¹³. D’autres modifications des méthodes WISH sont basées sur des recherches antérieures¹⁴, y compris la fixation supplémentaire et la coloration DAB. Il est prévu ici un protocole WISH amélioré qui peut fonctionner même si l’ARN cible est partiellement diminué ou dégradé. Les avantages incluent qu’il peut être complété en 24 h sans conditions sans RNase. Les signaux peuvent également être détectés simultanément par plusieurs canaux à partir de plusieurs cibles, et les résultats sont cohérents et compatibles avec les résultats de différentes plates-formes d’automatisation à haut débit.

Les résultats des modèles animaux ne reflètent pas nécessaire le même phénomène qui se produit chez l’homme. ENG contient deux paires de cystéines conservées, C30-C207 et C53-C182, qui forment des ponts de disulfide dans les régions orphelines. Pour étudier plus en plus le rôle de l’eng dans les patients HHT, les essais de formation de tube avec des iPSCs dérivés des patients de HHT ont été exécutés dans des cellules sans/avec des mutations d’eng (Cys30Arg, C30R)¹⁵. Après Kubota et coll. ont d’abord rapporté l’expérience de formation de tube¹⁶, l’essai a été développé de plusieurs façons. Il a été utilisé pour identifier les facteurs angiogéniques ou antiangiogéniques, définir les voies de signalisation dans l’angiogenèse, et identifier les gènes régulant l’angiogenèse¹⁷.

Avant la disponibilité des iPSC-ECs d’origine patiente, les chercheurs utilisaient principalement des EC cultivés pour étudier l’angiogénèse¹⁶. Cependant, pour les cellules endothéliales, il s’agit d’un défi technique de transduire des gènes exogènes avec un virus, en raison du nombre de passage limité que les CE peuvent subir. C’est parce qu’il n’y a guère assez de matériel cellulaire pour être recueilli à partir de vaisseaux humains soit de la chirurgie ou des donneurs approuvés appariés. Avec l’invention de la technique de génération iPSC par Shinya Yamanaka, ECs humains dérivés d’iPSC peuvent être utilisés de manière fiable dans des expériences in vitro, comme indiqué précédemment¹⁸.

L’utilisation de CPE transduits viralement avec un nombre et des passages limités peut être suffisante pour les études de signalisation, mais pour les études fonctionnelles, il est préférable de générer des lignées de cellules souches pluripotentes mutantes, (iPSCs ou CRISPER/Cas9-ciblé hESCs), puis les différencier en ECs pour les études d’angiogenèse qui utilisent des essais de formation de tube¹⁹. La formation de tube peut être employée pour évaluer la fonction des cellules endothéliales portant des mutations. Ce protocole décrit également la formation de tubes sur une plaque d’angiogenèse à glissement de diapositive, qui est une méthode facile, rentable et reproductible.

Le protocole ci-dessous fournit une méthode fiable et systémique pour étudier le rôle de gènes spécifiques dans la formation vasculaire, ainsi que des détails pour le modèle d’expression in vivo et la quantification fonctionnelle in vitro pour la modélisation des maladies humaines.