מוצג כאן הוא פרוטוקול עבור כל הר באתרו הכלאה של RNA ניתוח ב-דג זברה והיווצרות שפופרת שיטת החולה-נגזר המושרה תא גזע מתאים הנגזר ללמוד את התפקיד של אנגלין במערך כלי הדם.
התפתחות כלי הדם נקבעת על ידי הביטוי הרציף של גנים ספציפיים, אשר ניתן ללמוד על ידי ביצוע היברידיזציה באתרו הכלאה במהלך שלבים התפתחותיים שונים. כדי לחקור את התפקיד של אנדוגלין (eng) במערך הספינה במהלך ההתפתחות של telangiectasia מדמם תורשתי (hht), המוזולסטינו בתיווך ממוקדת ממוקד של eng ב-דג זברה משמשים לחקר הביטוי הזמני שלה פונקציות משויכות. כאן, כל הר של היברידיזציה באתרו (מאחל) הוא מועסק לניתוח של eng ואת הגנים שלה במורד הזרם של עוברי דג דג זברה. כמו כן, היווצרות צינור הרכבת מבוצעים החולה HHT-נגזר המושרה הנגרמת לתאי גזע מובחנים תאים אנדותל (iPSC-ECs; עם מוטציות eng ). אות ספציפית מערכת הגברה באמצעות הסכום כולו היברידיזציה באתרו – משאלה מספקת ברזולוציה גבוהה יותר ותוצאות הרקע התחתון בהשוואה לשיטות המסורתיות. כדי להשיג אות טוב יותר, הזמן לאחר הקיבעון מותאם ל 30 דקות לאחר הכלאה בדיקה. מכיוון שצביעת הקרינה הפלואורסצנטית אינה רגישה בעוברי הדגים, הוא מוחלף בכתמים משובצת יהלומים. בפרוטוקול זה, HHT המטופל נגזר הקווים iPSC המכיל מוטציה eng מובחנים לתאי האנדותל. לאחר ציפוי צלחת עם מטריקס קרום המרתף עבור 30 דקות ב 37 ° c, ipsc-ecs הם שנזרע כמו דופלקס לתוך בארות ושמרו על 37 ° c עבור 3 h. לאחר מכן, אורך הצינור ומספר הענפים מחושבים באמצעות תמונות מיקרוסקופיים. כך, עם הפרוטוקול המשופר הזה משאלה, זה מראה כי מופחתת ביטוי eng משפיע על היווצרות מחולל שורש בתוך העוברים בדגים. זה מאומת נוספת על ידי היווצרות צינור שפופרת באמצעות iPSC-ECs נגזר מטופל עם HHT. האלה מאשרים לאשר את התפקיד עבור eng בפיתוח כלי דם מוקדם.
מוטציה אחת ב eng (CD105) דווחה בחולים עם hht. המוטציה מובילה התפשטות EC מוגברת ומופחתת זרימה-1תיווך ECהתארכות 1,2. כמו כן דווח בעבר כי מחסור ב-ENG מפחית את הביטוי של סמנים אנדותל (כלומר, kdrl, cdh5, hey2) ב דג זברה3. אנדוגלין, המתבטא בעיקר בתאי האנדותל, היא גליקופרוטאין טרנסרפינת ופונקציות כקולטן לשינוי גורם הגדילה β (tgf-β) בני משפחה. הוא מכוון BMP9 קשירה על משטח התא כדי לווסת את הגן במורד הזרם, כולל Id1 ביטוי, כדי לגרום לבידול תא גזע לכיוון ecs4. כך, הגן eng משחק תפקידים חשוביםבתוךvasculogenesis ומחלות כלי דם אנושיים 5,6. בדקנו בעבר את ההשפעות של אנדוגלין מלמטה על היווצרות הספינה בעוברי דגים דג זברה, ואחריו ניתוח של ecs iPSCs-נגזר שנרכשו מחולה hht נושאת מוטציה eng 7. פרוטוקול זה מדגים את ההשפעות של המחסור ב-ENG על ביטוי סמן של מחולל קדמון והיווצרות שפופרת, שהיא שיטה הניתנות לכימות למדידת האנגיוגנזה של מבחנה.
כדי ללמוד eng מרחבית הביטוי הזמני, המשאלה מועסק כדי לזהות ביטוי גנים ב vivo8. באתרו היברידיזציה (ISH) היא שיטה של שימוש בבדיקות עם תוויות עם רצפים משלימים של חומצות גרעין היעד (DNA או mRNA) כדי לזהות ולהמחיש את היעד חומצות גרעין כלאיים בדגימה קבועה. התהליך מגביר אותות ביטוי גנים ב vivo והוא משמש כדי לזהות את הביטוי של גנים על ידי מיקרוסקופ. המשאלה היתה בשימוש נרחב בחיות מודל שונות, במיוחד ב דג זברה9. הוא משמש גם כדי לרכוש את הנתונים הבאים: 1) ביטויים מרחביים/זמני גנים, אשר מספקים מידע על פונקציה גנטית וסיווג; ו-2) הביע במפורש סמנים גנים המשמשים בשימוש בתפוקה גבוהה או בסינון מוטציה10.
בדיקות כרומוגניים מושפל בקלות עם כרומוזום מסורתי היברידיזציה באתרו (cish), אשר מביא רעש רקע גבוהואותות לאספציפיים,12. שיטת המשאלה משתמשת בשני בדיקה עצמאית כפולה Z, אשר נועדו לhybridize היעד רצפי RNA. כל בדיקה מכילה רצף 18-25 המשלים ל-RNA היעד ו 14 בסיס הזנב רצף (המשדר כ Z). בבדיקות היעד נעשה שימוש בזוג (כפול Z). שני רצפי הזנב יחד טופס 28 הכלאה בסיס האתר עבור מגבר הקדם, אשר מכיל 20 אתרי מחייב עבור המגבר. המגבר, בתורו, מכיל 20 אתרי קשירה עבור בדיקה התווית והוא יכול תיאורטית להניב עד 8,000 תוויות עבור כל מטרה RNA רצף.
טכנולוגיה מתקדמת זו מאפשרת הגברה זמנית של אותות ודיכוי רקע כדי להשיג הדמיה חד-מולקולות תוך שמירה על מורפולוגיה של רקמות13. שינוי נוסף של שיטות המשאלה מבוסס על מחקר הקודם14, כולל קיבעון נוסף וכתמים מכתים. בתנאי כאן הוא פרוטוקול משאלה משופרת שיכול לעבוד גם אם RNA היעד הוא ירד או מושפל חלקית. היתרונות כוללים כי ניתן להשלימה 24 שעות ללא RNase-ללא תנאים. ניתן גם לזהות אותות בו באמצעות ערוצים מרובים מיעדים מרובים, והתוצאות עקביות ותואמות לתוצאות של פלטפורמות אוטומציה שונות בתפוקה גבוהה.
תוצאות מדגמי בעלי חיים אינם נחוצים לשיקוף התופעה המתרחשת אצל בני האדם. ב-ENG מצויים שני זוגות של ציסטרינס, C30-C207 ו-C53-C182, היוצרים גשרים דיגוניים באזורים היתומים. כדי ללמוד עוד יותר את התפקיד של eng ב-hht חולים, היווצרות tube בחני עם iPSCs נגזר מהחולים hht בוצעו בתאים ללא/עם מוטציות eng (Cys30Arg, C30R)15. לאחר שקוביטה ואח ‘ דיווח תחילה על היווצרות הצינור בניסוי16, המבנה פותח במספר דרכים. הוא משמש כדי לזהות גורמים אנגיוגנטיים או אנטי-אנגיוגנטיים, להגדיר את מסלולים איתות באנגיוגנזה, ולזהות גנים המסדירים אנגיוגנזה17.
לפני הזמינות של iPSC-ECs המטופל, החוקרים השתמשו ECs תרבותי בעיקר כדי ללמוד angiogensis16. עם זאת, עבור תאי האנדותל, זהו אתגר טכני כדי לשנות גנים אקסוגני עם וירוס, בגלל מספר מעבר מוגבל ECs יכול לעבור. הסיבה לכך היא בקושי מספיק חומר הסלולר כדי לאסוף מכלי הדם או מהניתוח או תורמים שאושרו בהתאמה. עם ההמצאה של טכניקת הדור iPSC ידי שינא יאמאנאקה, ECs האדם נגזר iPSCs יכול לשמש באופן אמין בניסויים מבחנה, כפי שדווח בעבר18.
שימוש ב-ecs התמרה ויראלי עם מספרים מוגבלים ומעברים עשוי להיות מספיק עבור מחקרים איתות, אבל עבור מחקרים פונקציונליים, עדיף ליצור שורות של תא גזע המוטציות pluripotent (או iPSCs או כריסי/Cas9-ממוקד hESCs), ואז להבדיל אותם ל-ecs למחקרים אנגיוגנזה להשתמשבחניהיווצרות שפופרת היווצרות צינור ניתן להשתמש כדי להעריך את הפונקציה של תאים אנדותל הנושאת מוטציות. פרוטוקול זה מתאר גם את היווצרות הצינורית על צלחת האנגיוגנזה של μ-שקופית, המהווה שיטה קלה, חסכונית ומתוכבת.
הפרוטוקול המופיע להלן מספק שיטה אמינה ומערכתית ללימוד התפקיד של גנים ספציפיים במערך כלי הדם, יחד עם פרטים על תבנית ביטוי vivo ובכמת מחוץ לגוף לצורך דוגמנות מחלות אנושיות.
פרוטוקול זה הוחל שיפור משופר הר הפלטפורמה באתרו של ה-RNA פלטפורמת היווצרות שפופרת של דג ומערכת צינור על iPSC-ECs נגזר מחולה HHT. שיטת ISH המסורתית מחייבת מחזור ניסיוני ארוך יותר עם צעדים ניסיוניים נוספים. הפרוטוקול יש כמה שיפורים חשובים, השימוש של בדיקה עצמאית כפולה Z ו iPSCs נגזר ממטופל עם hht שהוחלו ב…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו הייתה נתמכת על ידי מענקים מתוכנית המחקר ופיתוח של המפתח הלאומי של סין, תאי גזע ומחקר טרנסלtional [מספר 2016YFA0102300 (כדי יוני יאנג)]; הקרן למדעי הטבע של סין [גרנט מספר 81870051, 81670054 (ליוני יאנג)]; קרן חדשנות מצלמות למדעי הרפואה (CIFMS) [גרנט מספר 2016-I2M-4-003 (כדי יוני יאנג)]; הנוער PUMC נמצא ואת קרנות המחקר הבסיסי של האוניברסיטאות המרכזיות [מספר 2017310013 (לפאנג ג’ואו)].
µ-Slide Angiogenesis | ibidi | 81506 | Cell culture |
Amp 1-FL | ACD | SDS 320852 | Signal Amplification |
Amp 2-FL | ACD | SDS 320853 | Signal Amplification |
Amp 3-FL | ACD | SDS 320854 | Signal Amplification |
Amp 4 Alt B-FL | ACD | SDS 320856 | Signal Amplification |
Corning Matrigel Matrix | Corning | 354234 | Growth factor-reduced Matrigel |
DEPC | Sigma | D5758 | RNAase-free Water |
Human Endothelial-SFM | Thermofisher | 11111044 | Cell culture |
Paraformaldehyde | Sigma | 30525-89-4 | Fixed embryos |
Paraformaldehyde | Sigma | 30525-89-4 | Fixed Cells |
Protease K | ACD | SDS 322337 | Digest tissue |
Sodium Citrate | Sigma | 6132-04-3 | SSCT solution: Wash Buffer |
VEGF-165 | STEMCELL Technologies | 78073 | Growth factor |