斑马鱼胚胎全山原位杂交和管状测定在iPSC-ECs中研究恩多林在血管发育中的作用

在HHT患者中eng报告了eng（CD105）的单突变。突变导致EC增殖增加和减少流动介导EC伸长^11，2。2也曾报道，ENG缺乏减少内皮标记表达（即，kdrl，cdh5，嘿2）在斑马鱼cdh5^3。Endoglin，主要以内皮细胞表示，是一种跨膜糖蛋白，是转化生长因子β（TGF-+）家庭成员的共同受体。它引导BMP9结合在细胞表面，以调节下游基因，包括Id1表达，诱导干细胞分化到^ECs4。因此，eng基因在血管生成和人类血管疾病^55、66中起着重要的作用。我们以前曾研究过苯丙烯酶在斑马鱼胚胎中撞击血管形成的影响，然后分析从具有eng突变⁷的HHT患者那里获得的iPSCs衍生的ECs。该协议演示了ENG缺乏对内皮祖体标记表达和管的形成的影响，这是一种测量体外血管生成的方法。

为了研究英语空间和时间表达，WISH用于检测体内基因表达^8。原位杂交 （ISH） 是一种使用带有目标核酸（DNA 或 mRNA）补充序列的标签探头来检测和可视化固定试样中的目标核酸混合物的方法。该过程放大体内的基因表达信号，用于通过显微镜检测基因的表达。WISH已广泛应用于各种模型动物，特别是在斑马鱼^9。它还用于获取以下数据：1）基因空间/时间表达模式，提供有关基因功能和分类的信息;和2）专门表示基因标记，用于高通量药物或突变筛选^10。

色谱探针容易降解与传统的染色体原位杂交（CISH），导致高背景噪声和非特异性信号^{11，12。11,}WISH方法使用两个独立的双Z探针，它们被设计成杂交以靶向RNA序列。每个探针包含一个与目标RNA互补的18-25序列和14个基尾序列（概念化为Z）。目标探头用于对（双 Z）。两个尾部序列共同形成前置放大器的 28 个基本混合站点，其中包含 20 个放大器的绑定位点。放大器，反过来，包含20个结合点的标签探头，理论上可以产生高达8，000个标签为每个目标RNA序列。

这一先进技术有助于同时进行信号放大和背景抑制，实现单分子可视化，同时保持组织形态^13。WISH方法的进一步修改是基于先前的研究^14，包括额外的固定和DAB染色。此处提供了改进的 WISH 协议，即使目标 RNA 部分减少或降解，也可以工作。优点包括可在 24 小时内完成，无需无 RNase 条件。信号也可以通过多个目标的多个通道同时检测，结果与不同高通量自动化平台的结果一致且兼容。

动物模型的结果没有必要反映人类发生的相同现象。ENG包含两对保守的半胱氨酸，C30-C207和C53-C182，在孤儿区形成不硫化桥梁。为了进一步研究eng在HHT患者中的作用，从HHT患者衍生的iPSC的管状检测已经在没有/有eng突变的细胞中进行（Cys30Arg，C30R）15。¹⁵在久保田等人首次报告管状实验¹⁶后，该测定已经以多种方式得到开发。它已被用于识别血管生成或抗血管生成因子，定义血管生成的信号通路，并确定调节血管生成的基因^17。

在提供患者衍生的iPSC-ECs之前，研究人员主要使用培养的酶来研究血管原体^16。然而，对于内皮细胞来说，用病毒转导外源基因是一项技术挑战，因为ECs可以经历的通道数量有限。这是因为几乎没有足够的细胞材料从人类血管收集，无论是从手术或匹配批准的捐赠者。随着iPSC生成技术的发明，由iPSC衍生的人类EC可以可靠地用于体外实验，如前¹⁸日报道。

使用病毒转导的ECs的数量和通道可能足以信号研究，但对于功能研究，最好产生突变多能干细胞系，（或iPSCs或CRISPER/Cas9目标hESCs），然后将它们区分成ECs，用于使用管形测定¹⁹的血管生成研究。管的形成可用于评估具有突变的内皮细胞的功能。该协议还描述了α-滑动血管生成板上的管状，这是一种简单、经济、可重复的方法。

下面的协议提供了一个可靠和系统的方法，用于研究特定基因在血管形成中的作用，以及体内表达模式和体外功能定量的细节，用于模拟人类疾病。