Целая гора В Ситу Гибридизация в зебрафиш эмбрионов и трубоусветки Ассав в iPSC-ECs для изучения роли эндоглин в сосудистом развитии
Summary
Представлено здесь протокол для всего монтажа на месте РНК гибридизации анализа в зебрафиш и трубки формирования анализа в пациента полученных плюрипотентных стволовых клеток, полученных эндотелиальных клеток для изучения роли эндоглина в сосудистой формирования.
Abstract
Сосудистое развитие определяется последовательным выражением конкретных генов, которые могут быть изучены, выполняя на месте гибридизации анализов у зебры на различных стадиях развития. Для изучения роли эндоглина (анг) в формировании сосудов во время развития наследственной геморрагической телеангиэктазии (HHT), морфолино-опосредованный целенаправленный нокдаун eng у зебры используются для изучения его височной экспрессии и связанных с ними функций. Здесь, всего монтажа на месте РНК гибридизации (WISH) используется для анализа eng и его вниз по течению генов в эмбрионах зебры. Кроме того, анализы формирования труб выполняются в HHT пациента полученных плюрипотентных стволовых клеток дифференцированных эндотелиальных клеток (iPSC-ECs; с eng мутаций). Специфическая система усиления сигнала, использующая всю сумму В Situ Hybridization – WISH обеспечивает более высокое разрешение и более низкие фоновые результаты по сравнению с традиционными методами. Чтобы получить лучший сигнал, время после фиксации корректируется до 30 мин после гибридизации зонда. Поскольку флуоресценция окрашивания не является чувствительным в эмбрионах зебры, он заменяется диаминобезидин (DAB) окрашивания здесь. В этом протоколе линии iPSC, полученные от HHT пациента, содержащие мутацию eng, дифференцированы в эндотелиальные клетки. После покрытия пластины с подвальной мембранной матрицы в течение 30 минут при 37 градусов по Цельсию, iPSC-ECs посеяны в качестве монослой в колодцы и хранятся при 37 градусов по Цельсию в течение 3 ч. Затем длина трубки и количество ветвей рассчитываются с помощью микроскопических изображений. Таким образом, с этим улучшенным протоколом WISH, показано, что снижение экспрессии eng влияет на образование эндотелиальных прародителей в эмбрионах зебры. Это также подтверждается анализами формирования трубки с использованием iPSC-ECs, полученных от пациента с HHT. Эти анализы подтверждают роль eng в раннем развитии сосудов.
Introduction
Одна мутация на eng (CD105) была зарегистрирована у пациентов с HHT. Мутация приводит к увеличению пролиферации ЕС и уменьшению потока опосредованного удлинения ЕС1,2. Кроме того, ранее сообщалось, что дефицит ENG снижает экспрессию эндотелиальных маркеров (т.е. kdrl, cdh5, hey2) у зебры3. Эндоглин,в основном выраженный в эндотелиальных клетках, является трансмембранным гликопротеином и функционирует как ко-рецептор для преобразования фактора роста (TGF-) членов семьи. Он направляет bMP9 связывания на поверхности клетки для регулирования вниз по течению гена, в том числе id1 выражение, чтобы вызвать дифференциацию стволовых клеток к ECs4. Таким образом, ген eng играет важную роль в васкулогенезе и сосудистом заболевании человека5,,6. Мы ранее рассмотрели влияние эндоглинное нокдауна на формирование сосудов в эмбрионах зебры, после чего был проведен анализ eCs, полученных iPSCs, приобретенных у пациента HHT, несущего eng мутацию7. Этот протокол демонстрирует влияние дефицита ЭНГ на экспрессию эндотелиального маркера-прародителя и образование труб, что является количественным методом измерения в пробирке ангиогенеза.
Для изучения пространственной и временной экспрессии, WISH используется для обнаружения экспрессии генов in vivo8. На месте гибридизации (ISH) является метод использования помеченных зондов с дополнением последовательностей целевых нуклеинных кислот (ДНК или мРНК) для обнаружения и визуализации целевых гибридов нуклеиновой кислоты в фиксированном образце. Процесс усиливает сигналы экспрессии генов in vivo и используется для обнаружения экспрессии генов с помощью микроскопии. WISH широко используется в различных образцовых животных, особенно у зебры9. Он также используется для получения следующих данных: 1) модели пространственного/временного выражения генов, которые предоставляют информацию о функции гена и классификации; и 2) специально выраженные генные маркеры, которые используются в высокопроизводительных наркотиков или мутантовскрининга 10.
Хромогенные зонды легко деградируют с традиционной хромосомой на месте гибридизации (CISH), что приводит к высокому фоновому шуму и неспецифических сигналов11,12. Метод WISH использует два независимых двойных зонда, которые предназначены для гибридизации для таргетинга последовательностей РНК. Каждый зонд содержит 18-25 последовательности, дополняющие целевую РНК и 14 базовых хвостовой последовательности (концептуализированный как К). Целевые зонды используются в паре (двойной). Две хвостовые последовательности вместе образуют 28 базовый сайт гибридизации для преусилителя, который содержит 20 связывающих участков для усилителя. Усилитель, в свою очередь, содержит 20 связывающих сайтов для зонда метки и теоретически может дать до 8000 меток для каждой целевой последовательности РНК.
Эта передовая технология облегчает одновременное усиление сигнала и подавление фона для достижения одномолекулярной визуализации при сохранении морфологии тканей13. Дальнейшая модификация методов WISH основана на предыдущих исследованиях14,включая дополнительную фиксацию и окрашивание DAB. Здесь предусмотрен улучшенный протокол WISH, который может работать, даже если целевая РНК частично уменьшена или деградирует. Преимущества включают в себя, что она может быть завершена в 24 ч без RNase условиях. Сигналы также могут быть одновременно обнаружены через несколько каналов от нескольких целей, и результаты являются последовательными и совместимыми с результатами различных платформ автоматизации высокой пропускной записи.
Результаты животных моделей не обязательно отражают то же явление, что происходит у людей. ENG содержит две пары консервированных цистеинов, C30-C207 и C53-C182, которые образуют дисульфидные мосты в сиротских регионах. Для дальнейшего изучения роли eng в HHT пациентов, трубки формирования анализы с iPSCs, полученных из пациентов HHT были проведены в клетках без / с eng мутаций (Cys30Arg, C30R)15. После того, как Кубота и др. впервые сообщили о эксперименте по образованию труб16,асссеия была разработана несколькими способами. Он был использован для выявления ангиогенных или антиангиогенных факторов, определить сигнальные пути в ангиогенезе, и определить гены, регулирующие ангиогенез17.
До наличия пациента полученных iPSC-ECs, исследователи использовали в первую очередь культивированные ECs для изучения ангиогенза16. Тем не менее, для эндотелиальных клеток, это техническая задача преобразовать экзогенных генов с вирусом, из-за ограниченного числа прохода, что ECs может пройти. Это потому, что вряд ли достаточно клеточного материала, чтобы быть собраны из человеческих сосудов либо от хирургии или соответствующих утвержденных доноров. С изобретением метода поколения iPSC Синья Яманака, оргтеи человека, полученные из iPSCs, могут быть надежно использованы в экспериментах in vitro, как сообщалось ранее18.
Использование вирусно трансиндуцированных ЭК с ограниченным количеством и проходов может быть достаточно для исследования сигналов, но для функциональных исследований, лучше генерировать мутант плюрипотентных стволовых клеток линий, (либо iPSCs или CRISPER / Cas9-целевых hESCs), а затем дифференцировать их в ECs для ангиогенеза исследований, которые используют трубки формирования анализы19. Формирование труб может быть использовано для оценки функции эндотелиальных клеток, несущих мутации. Этот протокол также описывает образование трубки на пластине ангиогенеза, которая является простым, экономичным и воспроизводимым методом.
Ниже протокол обеспечивает надежный и системный метод для изучения роли конкретных генов в сосудистом образовании, наряду с деталями для in vivo экспрессии шаблона и in vitro функциональной количественной оценки для моделирования заболеваний человека.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол применил улучшенную цельномонтажную платформу анализа РНК на месте для анализа зебры и анализов образования труб на iPSC-ECs, полученных от пациента HHT. Традиционный метод ISH требует более длительного экспериментального цикла с дополнительными экспериментальными шагами. Пр…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантами от Национальной ключевой программы исследований и разработок Китая-ствола клеток и трансляционных исследований (грант номер 2016YFA0102300 (в Цзюйнь Ян);Фонд науки о природе Китая (грант no 81870051, 81670054 (в Jun Yang)) ; Инновационный фонд медицинских наук CAMS (CIFMS) (грант No 2016-I2M-4-003 (в Цзюнь Ян)) ; PUMC Молодежный Найдено и фундаментальных научно-исследовательских фондов для центральных университетов (грант номер 2017310013 (к Fang Чжоу)) “.
Materials
| µ-Slide Angiogenesis | ibidi | 81506 | Cell culture |
| Amp 1-FL | ACD | SDS 320852 | Signal Amplification |
| Amp 2-FL | ACD | SDS 320853 | Signal Amplification |
| Amp 3-FL | ACD | SDS 320854 | Signal Amplification |
| Amp 4 Alt B-FL | ACD | SDS 320856 | Signal Amplification |
| Corning Matrigel Matrix | Corning | 354234 | Growth factor-reduced Matrigel |
| DEPC | Sigma | D5758 | RNAase-free Water |
| Human Endothelial-SFM | Thermofisher | 11111044 | Cell culture |
| Paraformaldehyde | Sigma | 30525-89-4 | Fixed embryos |
| Paraformaldehyde | Sigma | 30525-89-4 | Fixed Cells |
| Protease K | ACD | SDS 322337 | Digest tissue |
| Sodium Citrate | Sigma | 6132-04-3 | SSCT solution: Wash Buffer |
| VEGF-165 | STEMCELL Technologies | 78073 | Growth factor |
References
- Jin, Y., et al. Endoglin prevents vascular malformation by regulating flow-induced cell migration and specification through VEGFR2 signalling. Nature Cell Biology. 19 (6), 639-652 (2017).
- Sugden, W. W., et al. Endoglin controls blood vessel diameter through endothelial cell shape changes in response to haemodynamic cues. Nature Cell Biology. 19 (6), 653-665 (2017).
- Zhang, D., et al. Endoglin is a conserved regulator of vasculogenesis in zebrafish – implications for hereditary haemorrhagic telangiectasia. Bioscience Reports. 39 (5), (2019).
- Lawera, A., et al. Role of soluble endoglin in BMP9 signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (36), 17800-17808 (2019).
- Gallardo-Vara, E., Tual-Chalot, S., Botella, L. M., Arthur, H. M., Bernabeu, C. Soluble endoglin regulates expression of angiogenesis-related proteins and induction of arteriovenous malformations in a mouse model of hereditary hemorrhagic telangiectasia. Disease Models & Mechanisms. 11 (9), (2019).
- Gomez-Puerto, M. C., et al. Autophagy contributes to BMP type 2 receptor degradation and development of pulmonary arterial hypertension. The Journal of Pathology. 249 (3), 356-367 (2019).
- Kim, S. K., Henen, M. A., Hinck, A. P. Structural biology of betaglycan and endoglin, membrane-bound co-receptors of the TGF-beta family. Experimental Biology and Medicine. 244 (17), 1547-1558 (2019).
- Dakou, E., Vanbekbergen, N., Corradi, S., Kemp, C. R., Leyns, L. Whole-Mount In Situ Hybridization (WISH) Optimized for Gene Expression Analysis in Mouse Embryos and Embryoid Bodies. Methods in Molecular Biology. 1211, 27-40 (2014).
- Xiao, C., Gao, L., Hou, Y., Xu, C., Xiong, J. W. Chromatin-remodelling factor Brg1 regulates myocardial proliferation and regeneration in zebrafish. Nature Communications. 7, 13787 (2016).
- Isogai, S., Horiguchi, M., Weinstein, B. M. The vascular anatomy of the developing zebrafish: an atlas of embryonic and early larval development. 발생학. 230 (2), 278-301 (2001).
- Rosa, F. E., Santos, R. M., Rogatto, S. R., Domingues, M. A. Chromogenic in situ hybridization compared with other approaches to evaluate HER2/neu status in breast carcinomas. Brazilian Journal of Medical Biology Research. 46 (3), 207-216 (2013).
- Hauptmann, G., Lauter, G., Soll, I. Detection and signal amplification in zebrafish RNA FISH. Methods. 98, 50-59 (2016).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. The Journal of Molecular Diagnostics. 14 (1), 22-29 (2012).
- Gross-Thebing, T., Paksa, A., Raz, E. Simultaneous high-resolution detection of multiple transcripts combined with localization of proteins in whole-mount embryos. BMC Biology. 12 (1), 55 (2014).
- Fang, Z., et al. EXPRESS: Autologous correction in patient iPSC-ECs to identify a novel pathogenic mutation of Hereditary Hemorrhagic Telangiectasia. Pulmonary Circulation. , (2019).
- Kubota, Y., Kleinman, H. K., Martin, G. R., Lawley, T. J. Role of laminin and basement membrane in the morphological differentiation of human endothelial cells into capillary-like structures. Journal of Cell Biology. 107 (4), 1589-1598 (1988).
- Clayton, Z. E., et al. Induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells promote angiogenesis and accelerate wound closure in a murine excisional wound healing model. Bioscience Reports. 38 (4), (2018).
- Rufaihah, A. J., et al. Endothelial Cells Derived From Human iPSCS Increase Capillary Density and Improve Perfusion in a Mouse Model of Peripheral Arterial Disease. Arteriosclerosis Thrombosis & Vascular Biology. 31 (11), e72-e79 (2011).
- Musunuru, K., Sheikh, F., Gupta, R. M., Houser, S. R., Wu, J. C. Induced Pluripotent Stem Cells for Cardiovascular Disease Modeling and Precision Medicine: A Scientific Statement From the American Heart Association. Clinical Genomics and Precision Medicine. 11 (1), e000043 (2018).
- Wang, L. Y., et al. Apelin attenuates TGF-β1-induced epithelial to mesenchymal transition via activation of PKC-ε in human renal tubular epithelial cells. Peptides. 96, 44-52 (2017).
- El Hallani, S., et al. Tumor and Endothelial Cell Hybrids Participate in Glioblastoma Vasculature. Biomed Research International. , 1-9 (2014).
- Anderson, C. M., et al. Fully Automated RNAscope In Situ Hybridization Assays for Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Cells and Tissues. Journal of Cellular Biochemistry. 117 (10), 2201-2208 (2016).
- Sun, X., Tan, G., Liew, R. Future challenges for patient-specific induced pluripotent stem cells in cardiovascular medicine. Expert Review of Cardiovascular Therapy. 10 (8), 943-945 (2012).
