Isolatie van hypothalamische microglia uit vers doorbloede volwassen muizenhersenen door magnetisch geactiveerde celsortering
Summary
We beschrijven een protocol voor het isoleren van microgliacellen uit de hypothalamus van de muis (of gelijkwaardige kleine hersenstructuren) met behulp van magnetisch geactiveerde celsortering (MACS), in een relatief korte tijd. De MACS-gesorteerde hypothalamische microglia kunnen worden gebruikt voor ex vivo-analyse en kunnen worden geplateerd om in vitro-assays uit te voeren.
Abstract
Microglia, als de inwonende macrofagen van de hersenen, zijn essentieel voor het handhaven van de homeostase van de hersenen. Ze vormen neuronale circuits tijdens de ontwikkeling, onderzoeken hun omgeving op puin of dode cellen en reageren op infectie en letsel in de hersenen, naast vele andere functies. Hun belangrijke rol in de neurologische ontwikkeling en synaptische plasticiteit en pathofysiologie is echter niet volledig gedefinieerd, wat de noodzaak van verder onderzoek benadrukt. Om een beter begrip te krijgen van de rol van microglia in deze processen, moeten we microglia isoleren en ze genetisch, metabolisch en functioneel karakteriseren. De isolatie van microglia uit volwassen muizen, vooral uit kleine hersenstructuren, is echter een uitdaging omdat ze een klein percentage van de totale hersencellen vertegenwoordigen en de opbrengst van geïsoleerde microglia vaak te laag is. Hier stelt de magnetische isolatie van microglia met behulp van CD11b+ microbeads ons in staat om microgliacellen te sorteren uit de hypothalamus van een vers doorbloed volwassen muizenbrein. De huidige methode stelt ons in staat om in korte tijd een relatief hoge zuiverheid en opbrengst te bereiken met behoud van cellevensvatbaarheid.
Introduction
Microglia komen overeen met 5-20% van de totale neurale cellen en zijn de enige gliacellen die afkomstig zijn van erytromyeloïde voorlopercellen in de dooierzak en beginnen met het koloniseren van de zich ontwikkelende hersenen rond embryonale dag E9.5 1,2. Het zijn langlevende cellen met het vermogen om zichzelf langzaam te vernieuwen, onafhankelijk van van beenmerg afgeleide cellen3. Als enkele van de meest dynamische cellen zijn ze in staat om verschillende fenotypes te verwerven als reactie op contextuele en omgevingssignalen 2,4. Van de signalen die hun activiteit kunnen moduleren, zijn schade aan het centrale zenuwstelsel (CZS), neuronale activiteit en voedingsstoffen het krachtigst. Een toenemend aantal onderzoeken heeft de cruciale rol van microglia bij letsel, neurodegeneratieve ziekten en obesitas aangetoond 2,5,6. Desalniettemin vereist de precieze rol van microglia in zowel fysiologische processen als pathofysiologie verder onderzoek. Daarom is hun transcriptionele, metabole en functionele karakterisering onder verschillende omstandigheden van groot belang en vereist hun isolatie, aangezien in situ-studies geschikt zijn voor DNA-, RNA- en eiwitlokalisatie en kwalitatieve vergelijkingen, evenals morfologische karakterisering van microglia.
Er zijn verschillende technieken beschreven voor microglia-isolatie, waaronder de Percoll-gradiëntmethode7, flowcytometrie celsortering (FACS)8 en magnetisch geactiveerde celsortering (MACS). De keuze van de geschikte methode hangt af van de doelstellingen van het onderzoek en het zuiverheidsniveau dat vereist is voor downstreamtoepassingen. De isolatie van pure microglia uit de hersenen van volwassen muizen, vooral uit kleine hersenstructuren zoals de hypothalamus, is een uitdaging vanwege het beperkte aantal microgliacellen. De geautomatiseerde zachte dissociatie van de hypothalamus met behulp van Miltenyi-technologie maakt het mogelijk om in korte tijd een relatief hoge microglia-opbrengst te zuiveren, met de mogelijkheid om tot acht monsters tegelijk te verwerken met een zachteMACS Octo-dissociator.
Weefselhomogenisatie wordt gevolgd door microglia-zuivering met behulp van de MACS-kolomgebaseerde technologie en de supermagnetische CD11b+-kralen van nanoformaat. Daarom worden alle monsters op precies dezelfde manier verwerkt, wat intacte CD11b+-cellen oplevert. Het is opmerkelijk dat CD11b niet uitsluitend aanwezig is in microglia, maar ook tot expressie komt op andere myeloïde afstammingscellen, waaronder macrofagen en monocyten9. Om dit te beperken, zorgt hersenperfusie met ijskoude zoutoplossing voorafgaand aan de hypothalamusextractie (zie protocolstap 2.6) voor de eliminatie van de meeste myeloïde cellen, waardoor er slechts een potentieel klein deel van de residente macrofagen of macrofagen overblijft die aan bloedvaten vastzitten. De residente macrofagen en monocyten van een gezond steady state CZS vormen een klein percentage van de totale immuuncellen in de hersenen (respectievelijk ~10% en <2%)10,11. Daarom, wanneer hersencellen worden gesorteerd met CD11b+ kralen, kunnen zowel microglia als macrofagen worden geïsoleerd, hoewel de overgrote meerderheid microglia zijn.
De eindopbrengst van microglia en het behoud van hun levensvatbaarheid stellen ons in staat om ex vivo en in vitro tests uit te voeren, met het voordeel dat we specifieke hersengebieden van belang kunnen analyseren. Het laatste bewijs heeft aangetoond dat de microglia-populatie zeer heterogeen is en regiospecifieke genexpressie en morfologische kenmerken en functie vertegenwoordigt 2,12,13. Daarom is het huidige protocol gericht op het isoleren en analyseren van volwassen microglia op een regiospecifieke manier. We kunnen inderdaad de genetische, transcriptionele en translationele profielen van volwassen hypothalamische microglia karakteriseren met behulp van methoden zoals RT-qPCR en RNA-sequencing, evenals het uitvoeren van in vitro functionele analyse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het huidige protocol presenteert de isolatie van hypothalamische microglia uit vers doorbloede volwassen muizenhersenen door middel van magnetisch geactiveerde celsortering. De hierboven gepresenteerde resultaten bevestigen de zuiverheid en levensvatbaarheid van geïsoleerde cellen, evenals de werkzaamheid van deze methode om microglia ex vivo functioneel te karakteriseren, bijvoorbeeld door middel van fagocytische activiteit en kwantificering van de ROS-productie. Klassieke methoden voor de isolatie van een spe…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
AN wordt ondersteund door het Institut Universitaire de France (IUF), de Universiteit van Bordeaux, de Franse Stichting voor Hersenonderzoek (FRC), de GLN (Lipid-Nutrition Group) en het National Research Agency (ANR, PRC 2023-MicroNRJ). CA werd gesteund door de Fondation pour la Recherche Médicale (FRM-ARF201809006962). Dit project is gefinancierd door het Horizon Europe Research and Innovation Program van de Europese Unie in het kader van de MSCA Doctoral Networks 2021, No. 101072759 (FuElThEbRaiNIn healthtThYaging and age-related diseases, ETERNITY.
Materials
| Adult Brain Dissociation Kit | Miltenyi | 130-107-677 | The kit contains buffer Z, buffer Y, enzymes A and P, Debris Removal Solution, buffer A (to dissolve enzyme A). |
| Albumin Bovine FrV BSA | EuroMedex | 04-100-812-C | |
| CD11b (Microglia) MicroBeads, human and mouse – small size | Miltenyi | 130-093-636 | |
| CellROX Green Flow Cytometry Assay Kit | Invitrogen | C10492 | |
| Centrifuge Tube, Snap-Pop Lid 15 mL | CellTreat | 978449 | |
| DPBS, calcium, magnesium, glucose, pyruvate | Gibco | 14287-072 | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi | 130-093-237 | |
| gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi | 130-096-427 | |
| Halt Phosphatase Inhibitor Cocktail (100x) | Thermofisher | 78420 | |
| Halt Protease Inhibitor Cocktail, EDTA free (100x) | Thermofisher | 78437 | |
| HBSS (10x), calcium, magnesium, no phenol red | Thermofisher | 14065056 | |
| Latex beads, carboxylate-modified polystyrene, fluorescent red | Sigma-Aldrich | L3280 | |
| LightCycler 480 SYBR Green I Master | Roche | 4707516001 | This reagent was used to perform PCR. |
| MACS SmartStrainers (70 µm) | Miltenyi | 130-110-916 | |
| Micro BCA Protein Assay Kit | Thermofisher | 23235 | |
| M-PER Mammalian Extraction Buffer | Thermofisher | 78503 | |
| MS Columns | Miltenyi | 130-042-201 | Referred as small columns in the protocol. |
| MultiMACS Cell24 Separator Plus | Miltenyi | 130-098-637 | |
| PBSS, pH 7.4 | Thermofisher | 10010023 | |
| qScript XLT cDNA SuperMix | Quanta biosciences | 733-1177 | The kit was used to syntesize cDNA. |
| ReliaPrep RNA Miniprep Systems | Promega | Z6011 | The kit contains 1-Thioglycerol and BL buffer (referred as lysis buffer in the protocol) and it was used to isolate total RNA. |
| Vacutainer safety-lok 21 G | Becton Dickinson | 367282 |
References
- Ginhoux, F., Lim, S., Hoeffel, G., Low, D., Huber, T. Origin and differentiation of microglia. Front Cell Neurosci. 7, 45 (2013).
- Paolicelli, R. C., et al. Microglia states and nomenclature: A field at its crossroads. Neuron. 110 (21), 3458-3483 (2022).
- Ajami, B., Bennett, J. L., Krieger, C., Tetzlaff, W., Rossi, F. M. V. Local self-renewal can sustain CNS microglia maintenance and function throughout adult life. Nat Neurosci. 10 (12), 1538-1543 (2007).
- Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
- Alexaki, V. I. The impact of obesity on microglial function: immune, metabolic and endocrine perspectives. Cells. 10 (7), 1584 (2021).
- Gao, C., Jiang, J., Tan, Y., Chen, S. Microglia in neurodegenerative diseases: mechanism and potential therapeutic targets. Sig Transduct Target Ther. 8 (1), 359 (2023).
- Lee, J. -. K., Tansey, M. G. Microglia isolation from adult mouse brain. Microglia: Methods Mol Biol. 1041, 17-23 (2013).
- Schwarz, J. Using fluorescence activated cell sorting to examine cell-type-specific gene expression in rat brain tissue. J Vis Exp. (2015), (2015).
- Lee, E., Eo, J. -. C., Lee, C., Yu, J. -. W. Distinct features of brain-resident macrophages: microglia and non-parenchymal brain macrophages. Mol Cells. 44 (5), 281-291 (2021).
- Korin, B., et al. High-dimensional, single-cell characterization of the brain’s immune compartment. Nat Neurosci. 20 (9), 1300-1309 (2017).
- Mrdjen, D., et al. High-dimensional single-cell mapping of central nervous system immune cells reveals distinct myeloid subsets in health, aging, and disease. Immunity. 48 (2), 380-395.e6 (2018).
- Grabert, K., et al. Microglial brain region−dependent diversity and selective regional sensitivities to aging. Nat Neurosci. 19 (3), 504-516 (2016).
- Tan, Y. -. L., Yuan, Y., Tian, L. Microglial regional heterogeneity and its role in the brain. Mol Psychiatry. 25 (2), 351-367 (2020).
- Bustin, S. A., et al. The MIQE Guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem. 55 (4), 611-622 (2009).
- . Available from: https://pamgene.com/wp-content/uploads/2022/03/1160-Preparation-Lysates-of-Cell-Lines-or-Purified-Cells-V4.2-2022-03.pdf (2022)
- Fonseca, M. I., et al. Cell-specific deletion of C1qa identifies microglia as the dominant source of C1q in mouse brain. J Neuroinflamm. 14 (1), 48 (2017).
- Simpson, D. S. A., Oliver, P. L. ROS generation in microglia: understanding oxidative stress and inflammation in neurodegenerative disease. Antioxidants. 9 (8), 743 (2020).
- Galloway, D. A., Phillips, A. E. M., Owen, D. R. J., Moore, C. S. Phagocytosis in the brain: homeostasis and disease. Front Immunol. 10, 790 (2019).
- Marsh, S. E., et al. Dissection of artifactual and confounding glial signatures by single-cell sequencing of mouse and human brain. Nat Neurosci. 25 (3), 306-316 (2022).
- DePaula-Silva, A. B., et al. Differential transcriptional profiles identify microglial- and macrophage-specific gene markers expressed during virus-induced neuroinflammation. J Neuroinflammation. 16 (1), 152 (2019).
