عزل الخلايا الدبقية الصغيرة تحت المهاد من دماغ الفأر البالغ الطازج عن طريق فرز الخلايا المنشطة مغناطيسيا
Summary
وصفنا بروتوكولا لعزل الخلايا الدبقية الصغيرة من منطقة ما تحت المهاد (أو هياكل الدماغ الصغيرة المكافئة) باستخدام فرز الخلايا المنشط مغناطيسيا (MACS) ، في وقت قصير نسبيا. يمكن استخدام الخلايا الدبقية الصغيرة تحت المهاد المصنفة بواسطة MACS للتحليل خارج الجسم الحي ويمكن طلاءها لإجراء فحوصات في المختبر .
Abstract
الخلايا الدبقية الصغيرة ، باعتبارها الضامة المقيمة في الدماغ ، ضرورية للحفاظ على توازن الدماغ. إنها تشكل الدوائر العصبية أثناء التطور ، وتمسح بيئتها بحثا عن الحطام أو الخلايا الميتة ، وكذلك تستجيب للعدوى والإصابة في الدماغ ، من بين العديد من الوظائف الأخرى. ومع ذلك ، لم يتم تحديد دورها المهم في النمو العصبي واللدونة المشبكية والفيزيولوجيا المرضية بشكل كامل ، مما يسلط الضوء على الحاجة إلى مزيد من التحقيق. للحصول على فهم أكثر شمولا لدور الخلايا الدبقية الصغيرة في هذه العمليات ، نحتاج إلى عزل الخلايا الدبقية الصغيرة وتوصيفها وراثيا واستقلابيا ووظيفيا. ومع ذلك ، فإن عزل الخلايا الدبقية الصغيرة من الفئران البالغة ، وخاصة من هياكل الدماغ الصغيرة ، يمثل تحديا لأنها تمثل نسبة صغيرة من إجمالي خلايا الدماغ ، وغالبا ما يكون إنتاج الخلايا الدبقية الصغيرة المعزولة منخفضا جدا. هنا ، يسمح لنا العزل المغناطيسي للخلايا الدبقية الصغيرة باستخدام ميكروبيدات CD11b + بفرز الخلايا الدبقية الصغيرة من منطقة ما تحت المهاد لدماغ فأر بالغ حديث النفاذ. تسمح لنا الطريقة الحالية بتحقيق نقاء وعائد مرتفعين نسبيا في فترة قصيرة مع الحفاظ على صلاحية الخلية.
Introduction
تتوافق الخلايا الدبقية الصغيرة مع 5-20٪ من إجمالي الخلايا العصبية وهي الخلايا الدبقية الوحيدة التي تنشأ من أسلاف الكريات الحمر في كيس الصفار وتبدأ في استعمار الدماغ النامي حول اليوم الجنيني E9.5 1,2. إنها خلايا طويلة العمر مع القدرة على الخضوع للتجديد الذاتي ببطء ، بشكل مستقل عن الخلايا المشتقة من نخاع العظام3. باعتبارها بعض الخلايا الأكثر ديناميكية ، فهي قادرة على اكتساب أنماط ظاهرية متنوعة استجابة للإشارات السياقية والبيئية 2,4. من بين الإشارات القادرة على تعديل نشاطها ، فإن تلف الجهاز العصبي المركزي (CNS) ، والنشاط العصبي ، وكذلك العناصر الغذائية ، هي الأكثر فعالية. أظهرت مجموعة متزايدة من الأبحاث الدور المحوري للخلايا الدبقية الصغيرة في الإصابة والأمراض التنكسية العصبية والسمنة2،5،6. ومع ذلك ، فإن الدور الدقيق للخلايا الدبقية الصغيرة في كل من العمليات الفسيولوجية والفيزيولوجيا المرضية يتطلب مزيدا من الدراسة. لذلك ، فإن توصيفها النسخي والأيضي والوظيفي في ظل ظروف مختلفة له أهمية كبيرة ويتطلب عزلها ، لأن الدراسات في الموقع مناسبة لتوطين الحمض النووي والحمض النووي الريبي والبروتين والمقارنات النوعية ، وكذلك التوصيف المورفولوجي للخلايا الدبقية الصغيرة.
هناك العديد من التقنيات الموصوفة لعزل الخلايا الدبقية الصغيرة ، من بينها طريقة التدرجPercoll 7 ، وفرز خلايا قياس التدفق الخلوي (FACS) 8 ، وفرز الخلايا المنشط مغناطيسيا (MACS). يعتمد اختيار الطريقة المناسبة على أهداف الدراسة ومستوى النقاء المطلوب للتطبيقات النهائية. إن عزل الخلايا الدبقية الصغيرة النقية عن دماغ الفأر البالغ ، وخاصة من هياكل الدماغ الصغيرة مثل منطقة ما تحت المهاد ، يمثل تحديا بسبب العدد المحدود من الخلايا الدبقية الصغيرة. يسمح التفكك اللطيف الآلي لمنطقة ما تحت المهاد باستخدام تقنية Miltenyi بتنقية محصول الخلايا الدبقية الصغيرة المرتفع نسبيا في وقت قصير مع القدرة على متابعة ما يصل إلى ثماني عينات في نفس الوقت باستخدام جهاز فك ارتباط OCTO لطيف MACS.
يتبع تجانس الأنسجة تنقية الخلايا الدبقية الصغيرة باستخدام تقنية MACS القائمة على العمود وحبات CD11b + فائقة المغناطيسية بحجم النانو. لذلك ، تتم معالجة جميع العينات بنفس الطريقة تماما مما ينتج عنه خلايا CD11b + سليمة. من الجدير بالذكر أن CD11b ليس موجودا حصريا في الخلايا الدبقية الصغيرة ولكن يتم التعبير عنه أيضا في خلايا النسب النخاعية الأخرى ، بما في ذلك الضامة والوحيدات9. للحد من ذلك ، يضمن تروية الدماغ بمحلول ملحي بارد قبل استخراج منطقة ما تحت المهاد (انظر خطوة البروتوكول 2.6) القضاء على معظم الخلايا النخاعية ، تاركا فقط جزءا صغيرا محتملا من الضامة المقيمة أو تلك الملتصقة بالأوعية الدموية. تشكل الضامة المقيمة والوحيدات في الجهاز العصبي المركزي المستقر السليم نسبة صغيرة من إجمالي الخلايا المناعية في الدماغ (~ 10٪ و <2٪ على التوالي)10,11. لذلك ، عندما يتم فرز خلايا الدماغ باستخدام حبات CD11b + ، يمكن عزل كل من الخلايا الدبقية الصغيرة والبلاعم ، على الرغم من أن الغالبية العظمى هي الخلايا الدبقية الصغيرة.
يتيح لنا العائد النهائي للخلايا الدبقية الصغيرة والحفاظ على صلاحيتها إجراء فحوصات خارج الجسم الحي ، وكذلك في المقايسات المختبرية ، مع ميزة تحليل مناطق معينة من الدماغ ذات الأهمية. أظهرت أحدث الأدلة أن مجموعة الخلايا الدبقية الصغيرة غير متجانسة للغاية ، وتمثل التعبير الجيني الخاص بالمنطقة والخصائص المورفولوجية والوظيفة2،12،13. لذلك ، يهدف البروتوكول الحالي إلى عزل وتحليل الخلايا الدبقية الصغيرة البالغة بطريقة خاصة بالمنطقة. في الواقع ، يمكننا توصيف الملامح الجينية والنسخية والانتقالية للخلايا الدبقية الصغيرة تحت المهاد للبالغين باستخدام طرق مثل RT-qPCR وتسلسل الحمض النووي الريبي ، بالإضافة إلى إجراء التحليل الوظيفي في المختبر .
Protocol
Representative Results
Discussion
يقدم البروتوكول الحالي عزل الخلايا الدبقية الصغيرة تحت المهاد من دماغ الفأر البالغ الذي تم اختراقه حديثا عن طريق فرز الخلايا المنشط مغناطيسيا. تؤكد النتائج المعروضة أعلاه نقاء الخلايا المعزولة وقابليتها للحياة ، فضلا عن فعالية هذه الطريقة في توصيف الخلايا الدبقية الصغيرة خارج الجسم</e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يتم دعم AN من قبل المعهد الجامعي الفرنسي (IUF) ، وجامعة بوردو ، والمؤسسة الفرنسية لأبحاث الدماغ (FRC) ، و GLN (مجموعة تغذية الدهون) ، والوكالة الوطنية للبحوث (ANR ، PRC 2023-MicroNRJ). وحظيت الزراعة المحافظة على الموارد بدعم من مؤسسة البحوث الطبية (FRM-ARF201809006962). تلقى هذا المشروع تمويلا من برنامج Horizon Europe للبحث والابتكار التابع للاتحاد الأوروبي في إطار شبكات الدكتوراه MSCA 2021 ، رقم 101072759 (FuElThEbRaiNIn healtThYaging والأمراض المرتبطة بالعمر ، الخلود.
Materials
| Adult Brain Dissociation Kit | Miltenyi | 130-107-677 | The kit contains buffer Z, buffer Y, enzymes A and P, Debris Removal Solution, buffer A (to dissolve enzyme A). |
| Albumin Bovine FrV BSA | EuroMedex | 04-100-812-C | |
| CD11b (Microglia) MicroBeads, human and mouse – small size | Miltenyi | 130-093-636 | |
| CellROX Green Flow Cytometry Assay Kit | Invitrogen | C10492 | |
| Centrifuge Tube, Snap-Pop Lid 15 mL | CellTreat | 978449 | |
| DPBS, calcium, magnesium, glucose, pyruvate | Gibco | 14287-072 | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi | 130-093-237 | |
| gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi | 130-096-427 | |
| Halt Phosphatase Inhibitor Cocktail (100x) | Thermofisher | 78420 | |
| Halt Protease Inhibitor Cocktail, EDTA free (100x) | Thermofisher | 78437 | |
| HBSS (10x), calcium, magnesium, no phenol red | Thermofisher | 14065056 | |
| Latex beads, carboxylate-modified polystyrene, fluorescent red | Sigma-Aldrich | L3280 | |
| LightCycler 480 SYBR Green I Master | Roche | 4707516001 | This reagent was used to perform PCR. |
| MACS SmartStrainers (70 µm) | Miltenyi | 130-110-916 | |
| Micro BCA Protein Assay Kit | Thermofisher | 23235 | |
| M-PER Mammalian Extraction Buffer | Thermofisher | 78503 | |
| MS Columns | Miltenyi | 130-042-201 | Referred as small columns in the protocol. |
| MultiMACS Cell24 Separator Plus | Miltenyi | 130-098-637 | |
| PBSS, pH 7.4 | Thermofisher | 10010023 | |
| qScript XLT cDNA SuperMix | Quanta biosciences | 733-1177 | The kit was used to syntesize cDNA. |
| ReliaPrep RNA Miniprep Systems | Promega | Z6011 | The kit contains 1-Thioglycerol and BL buffer (referred as lysis buffer in the protocol) and it was used to isolate total RNA. |
| Vacutainer safety-lok 21 G | Becton Dickinson | 367282 |
References
- Ginhoux, F., Lim, S., Hoeffel, G., Low, D., Huber, T. Origin and differentiation of microglia. Front Cell Neurosci. 7, 45 (2013).
- Paolicelli, R. C., et al. Microglia states and nomenclature: A field at its crossroads. Neuron. 110 (21), 3458-3483 (2022).
- Ajami, B., Bennett, J. L., Krieger, C., Tetzlaff, W., Rossi, F. M. V. Local self-renewal can sustain CNS microglia maintenance and function throughout adult life. Nat Neurosci. 10 (12), 1538-1543 (2007).
- Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
- Alexaki, V. I. The impact of obesity on microglial function: immune, metabolic and endocrine perspectives. Cells. 10 (7), 1584 (2021).
- Gao, C., Jiang, J., Tan, Y., Chen, S. Microglia in neurodegenerative diseases: mechanism and potential therapeutic targets. Sig Transduct Target Ther. 8 (1), 359 (2023).
- Lee, J. -. K., Tansey, M. G. Microglia isolation from adult mouse brain. Microglia: Methods Mol Biol. 1041, 17-23 (2013).
- Schwarz, J. Using fluorescence activated cell sorting to examine cell-type-specific gene expression in rat brain tissue. J Vis Exp. (2015), (2015).
- Lee, E., Eo, J. -. C., Lee, C., Yu, J. -. W. Distinct features of brain-resident macrophages: microglia and non-parenchymal brain macrophages. Mol Cells. 44 (5), 281-291 (2021).
- Korin, B., et al. High-dimensional, single-cell characterization of the brain’s immune compartment. Nat Neurosci. 20 (9), 1300-1309 (2017).
- Mrdjen, D., et al. High-dimensional single-cell mapping of central nervous system immune cells reveals distinct myeloid subsets in health, aging, and disease. Immunity. 48 (2), 380-395.e6 (2018).
- Grabert, K., et al. Microglial brain region−dependent diversity and selective regional sensitivities to aging. Nat Neurosci. 19 (3), 504-516 (2016).
- Tan, Y. -. L., Yuan, Y., Tian, L. Microglial regional heterogeneity and its role in the brain. Mol Psychiatry. 25 (2), 351-367 (2020).
- Bustin, S. A., et al. The MIQE Guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem. 55 (4), 611-622 (2009).
- . Available from: https://pamgene.com/wp-content/uploads/2022/03/1160-Preparation-Lysates-of-Cell-Lines-or-Purified-Cells-V4.2-2022-03.pdf (2022)
- Fonseca, M. I., et al. Cell-specific deletion of C1qa identifies microglia as the dominant source of C1q in mouse brain. J Neuroinflamm. 14 (1), 48 (2017).
- Simpson, D. S. A., Oliver, P. L. ROS generation in microglia: understanding oxidative stress and inflammation in neurodegenerative disease. Antioxidants. 9 (8), 743 (2020).
- Galloway, D. A., Phillips, A. E. M., Owen, D. R. J., Moore, C. S. Phagocytosis in the brain: homeostasis and disease. Front Immunol. 10, 790 (2019).
- Marsh, S. E., et al. Dissection of artifactual and confounding glial signatures by single-cell sequencing of mouse and human brain. Nat Neurosci. 25 (3), 306-316 (2022).
- DePaula-Silva, A. B., et al. Differential transcriptional profiles identify microglial- and macrophage-specific gene markers expressed during virus-induced neuroinflammation. J Neuroinflammation. 16 (1), 152 (2019).
