Isolamento della microglia ipotalamica dal cervello di topo adulto appena perfuso mediante smistamento cellulare attivato magneticamente
Summary
Descriviamo un protocollo per isolare le cellule microgliali dall’ipotalamo del topo (o piccole strutture cerebrali equivalenti) utilizzando il cell sorting attivato magneticamente (MACS), in un tempo relativamente breve. La microglia ipotalamica selezionata con MACS può essere utilizzata per analisi ex vivo e può essere piastrata per eseguire saggi in vitro .
Abstract
Le microglia, in quanto macrofagi residenti nel cervello, sono essenziali per il mantenimento dell’omeostasi cerebrale. Modellano i circuiti neuronali durante lo sviluppo, esaminano il loro ambiente alla ricerca di detriti o cellule morte, oltre a rispondere a infezioni e lesioni nel cervello, tra molte altre funzioni. Tuttavia, il loro ruolo importante nello sviluppo neurologico e nella plasticità sinaptica e fisiopatologica non è stato completamente definito, evidenziando la necessità di ulteriori indagini. Per ottenere una comprensione più completa del ruolo delle microglia in questi processi, dobbiamo isolare le microglia e caratterizzarle geneticamente, metabolicamente e funzionalmente. Tuttavia, l’isolamento delle microglia da topi adulti, in particolare da piccole strutture cerebrali, è impegnativo in quanto rappresentano una piccola percentuale delle cellule cerebrali totali e la resa delle microglia isolate è spesso troppo bassa. Qui, l’isolamento magnetico della microglia utilizzando microsfere CD11b+ ci consente di selezionare le cellule microgliali dall’ipotalamo di un cervello di topo adulto appena perfuso. Il metodo attuale ci consente di ottenere una purezza e una resa relativamente elevate in un breve periodo, mantenendo la vitalità cellulare.
Introduction
Le microglia corrispondono al 5-20% del totale delle cellule neurali e sono le uniche cellule gliali che originano dai progenitori eritromieloidi nel sacco vitellino e iniziano a colonizzare il cervello in via di sviluppo intorno al giorno embrionale E9.5 1,2. Sono cellule longeve con la capacità di autorinnovarsi lentamente, indipendentemente dalle cellule derivate dal midollo osseo3. Essendo alcune delle cellule più altamente dinamiche, sono in grado di acquisire diversi fenotipi in risposta a segnali contestuali e ambientali 2,4. Tra i segnali in grado di modulare la loro attività, il danno al sistema nervoso centrale (SNC), l’attività neuronale, così come i nutrienti, sono i più potenti. Un numero crescente di ricerche ha dimostrato il ruolo fondamentale della microglia nelle lesioni, nelle malattie neurodegenerative e nell’obesità 2,5,6. Tuttavia, il ruolo preciso della microglia sia nei processi fisiologici che nella fisiopatologia richiede ulteriori studi. Pertanto, la loro caratterizzazione trascrizionale, metabolica e funzionale in diverse condizioni è di grande importanza e richiede il loro isolamento, poiché gli studi in situ sono appropriati per la localizzazione di DNA, RNA e proteine e per i confronti qualitativi, nonché per la caratterizzazione morfologica delle microglia.
Esistono varie tecniche descritte per l’isolamento delle microglia, tra cui il metodo del gradiente di Percoll7, la selezione cellulare con citometria a flusso (FACS)8 e la selezione cellulare attivata magneticamente (MACS). La scelta del metodo appropriato dipende dagli obiettivi dello studio e dal livello di purezza richiesto per le applicazioni a valle. L’isolamento della microglia pura dal cervello del topo adulto, in particolare da piccole strutture cerebrali come l’ipotalamo, è difficile a causa del numero limitato di cellule microgliali. La delicata dissociazione automatizzata dell’ipotalamo utilizzando la tecnologia Miltenyi consente la purificazione di una resa di microglia relativamente elevata in breve tempo, con la possibilità di procedere fino a otto campioni contemporaneamente con un dissociatore octo delicato MACS.
L’omogeneizzazione dei tessuti è seguita dalla purificazione della microglia utilizzando la tecnologia MACS basata su colonna e le microsfere CD11b+ supermagnetiche di dimensioni nanometriche. Pertanto, tutti i campioni vengono processati esattamente allo stesso modo, producendo cellule CD11b+ intatte. È interessante notare che CD11b non è presente esclusivamente nelle microglia, ma è espresso anche su altre cellule della linea mieloide, inclusi macrofagi e monociti9. Per limitare questo, la perfusione cerebrale con soluzione salina ghiacciata prima dell’estrazione dell’ipotalamo (vedi fase 2.6 del protocollo) garantisce l’eliminazione della maggior parte delle cellule mieloidi, lasciando solo una frazione potenzialmente piccola dei macrofagi residenti o di quelli aderiti ai vasi sanguigni. I macrofagi e i monociti residenti in un sistema nervoso centrale sano allo stato stazionario costituiscono una percentuale minore del totale delle cellule immunitarie cerebrali (rispettivamente ~10% e <2%)10,11. Pertanto, quando le cellule cerebrali vengono selezionate con perle CD11b+, sia la microglia che i macrofagi possono essere isolati, sebbene la stragrande maggioranza siano microglia.
La resa finale delle microglia e il mantenimento della loro vitalità ci permettono di eseguire saggi ex vivo, così come in vitro, con il vantaggio di analizzare specifiche regioni cerebrali di interesse. Le ultime evidenze hanno dimostrato che la popolazione di microglia è altamente eterogenea, rappresentando l’espressione genica specifica della regione e le caratteristiche morfologiche e la funzione 2,12,13. Pertanto, l’attuale protocollo mira a isolare e analizzare la microglia adulta in modo region-specific. Infatti, siamo in grado di caratterizzare i profili genetici, trascrizionali e traduzionali della microglia ipotalamica adulta utilizzando metodi come la RT-qPCR e il sequenziamento dell’RNA, oltre a eseguire analisi funzionali in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’attuale protocollo prevede l’isolamento di microglia ipotalamiche da cervello di topo adulto appena perfuso mediante Magnetic-Activated Cell Sorting. I risultati presentati sopra confermano la purezza e la vitalità delle cellule isolate, nonché l’efficacia di questo metodo per caratterizzare funzionalmente le microglia ex vivo, ad esempio attraverso l’attività fagocitaria e la quantificazione della produzione di ROS. I metodi classici per l’isolamento di una specifica popolazione cellulare potrebbero essere…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
L’AN è sostenuta dall’Institut Universitaire de France (IUF), dall’Università di Bordeaux, dalla Fondazione francese per la ricerca sul cervello (FRC), dal GLN (Lipid-Nutrition Group) e dall’Agenzia nazionale per la ricerca (ANR, PRC 2023-MicroNRJ). CA è stata sostenuta dalla Fondation pour la Recherche Médicale (FRM-ARF201809006962). Questo progetto ha ricevuto finanziamenti dal programma di ricerca e innovazione Horizon Europe dell’Unione Europea nell’ambito delle reti di dottorato MSCA 2021, n. 101072759 (FuElThEbRaiNIn healtThYaging and age-related diseases, ETERNITY.
Materials
| Adult Brain Dissociation Kit | Miltenyi | 130-107-677 | The kit contains buffer Z, buffer Y, enzymes A and P, Debris Removal Solution, buffer A (to dissolve enzyme A). |
| Albumin Bovine FrV BSA | EuroMedex | 04-100-812-C | |
| CD11b (Microglia) MicroBeads, human and mouse – small size | Miltenyi | 130-093-636 | |
| CellROX Green Flow Cytometry Assay Kit | Invitrogen | C10492 | |
| Centrifuge Tube, Snap-Pop Lid 15 mL | CellTreat | 978449 | |
| DPBS, calcium, magnesium, glucose, pyruvate | Gibco | 14287-072 | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi | 130-093-237 | |
| gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi | 130-096-427 | |
| Halt Phosphatase Inhibitor Cocktail (100x) | Thermofisher | 78420 | |
| Halt Protease Inhibitor Cocktail, EDTA free (100x) | Thermofisher | 78437 | |
| HBSS (10x), calcium, magnesium, no phenol red | Thermofisher | 14065056 | |
| Latex beads, carboxylate-modified polystyrene, fluorescent red | Sigma-Aldrich | L3280 | |
| LightCycler 480 SYBR Green I Master | Roche | 4707516001 | This reagent was used to perform PCR. |
| MACS SmartStrainers (70 µm) | Miltenyi | 130-110-916 | |
| Micro BCA Protein Assay Kit | Thermofisher | 23235 | |
| M-PER Mammalian Extraction Buffer | Thermofisher | 78503 | |
| MS Columns | Miltenyi | 130-042-201 | Referred as small columns in the protocol. |
| MultiMACS Cell24 Separator Plus | Miltenyi | 130-098-637 | |
| PBSS, pH 7.4 | Thermofisher | 10010023 | |
| qScript XLT cDNA SuperMix | Quanta biosciences | 733-1177 | The kit was used to syntesize cDNA. |
| ReliaPrep RNA Miniprep Systems | Promega | Z6011 | The kit contains 1-Thioglycerol and BL buffer (referred as lysis buffer in the protocol) and it was used to isolate total RNA. |
| Vacutainer safety-lok 21 G | Becton Dickinson | 367282 |
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