בידוד של תאי מיקרוגליה היפותלמיים ממוח עכבר בוגר שזה עתה מחורר על ידי מיון תאים המופעלים על ידי מגנטית
Summary
אנו מתארים פרוטוקול לבידוד תאי מיקרוגליאה מההיפותלמוס של העכבר (או מבני מוח קטנים מקבילים) באמצעות מיון תאים מופעל מגנטית (MACS), בזמן קצר יחסית. מיקרוגליה היפותלמית ממוינת MACS יכולה לשמש לניתוח ex vivo וניתן לצפות אותה לביצוע בדיקות חוץ גופיות .
Abstract
מיקרוגליה, כמקרופאגים השוכנים במוח, חיוניים לשמירה על הומאוסטזיס במוח. הם מעצבים מעגלים עצביים במהלך ההתפתחות, סוקרים את סביבתם לאיתור פסולת או תאים מתים, כמו גם מגיבים לזיהום ופציעה במוח, בין פונקציות רבות אחרות. עם זאת, תפקידם החשוב בפיתוח עצבי ופלסטיות סינפטית ופתופיזיולוגיה לא הוגדר במלואו, מה שמדגיש את הצורך בחקירה נוספת. כדי לקבל הבנה מקיפה יותר של תפקיד תאי המיקרוגליה בתהליכים האלה, עלינו לבודד תאי מיקרוגליה ולאפיין אותם גנטית, מטבולית ותפקודית. אולם הבידוד של תאי מיקרוגליה מעכברים בוגרים, במיוחד ממבני מוח קטנים, הוא מאתגר מכיוון שהם מייצגים אחוז קטן מכלל תאי המוח, והתשואה של תאי מיקרוגליה מבודדים היא לעתים קרובות נמוכה מדי. כאן, הבידוד המגנטי של תאי מיקרוגליה באמצעות מיקרו-כדוריות CD11b+ מאפשר לנו למיין תאי מיקרוגליאה מההיפותלמוס של מוח עכבר בוגר שזה עתה נוקב. השיטה הנוכחית מאפשרת לנו להגיע לטוהר ותנובה גבוהים יחסית בתקופה קצרה תוך שמירה על כדאיות התא.
Introduction
מיקרוגליה מהווים 5-20% מכלל התאים העצביים והם תאי הגליה היחידים שמקורם באבות אריתרומיאלואידים בשק החלמון ומתחילים ליישב את המוח המתפתח סביב היום העוברי E9.5 1,2. מדובר בתאים מאריכי חיים בעלי יכולת התחדשות עצמית איטית, ללא תלות בתאים שמקורם במח עצם3. כחלק מהתאים הדינמיים ביותר, הם מסוגלים לרכוש פנוטיפים מגוונים בתגובה לרמזים הקשריים וסביבתיים 2,4. בין האותות המסוגלים לווסת את פעילותם, נזק למערכת העצבים המרכזית (CNS), פעילות עצבית, כמו גם חומרים מזינים, הם החזקים ביותר. גוף הולך וגדל של מחקרים הוכיח את התפקיד המרכזי של תאי מיקרוגליה בפציעות, מחלות נוירודגנרטיביות והשמנת יתר 2,5,6. עם זאת, התפקיד המדויק של מיקרוגליה הן בתהליכים פיזיולוגיים והן בפתופיזיולוגיה דורש מחקר נוסף. לכן, אפיון השעתוק, חילוף החומרים והתפקוד שלהם בתנאים שונים הוא בעל חשיבות רבה ומחייב את בידודם, שכן מחקרים באתרם מתאימים ללוקליזציה של DNA, RNA וחלבונים והשוואות איכותניות, כמו גם אפיון מורפולוגי של מיקרוגליה.
ישנן טכניקות שונות המתוארות לבידוד מיקרוגליה, ביניהן שיטת שיפוע פרקול7, מיון תאי ציטומטריה זרימה (FACS)8, ומיון תאים מופעלים מגנטית (MACS). בחירת השיטה המתאימה תלויה במטרות המחקר וברמת הטוהר הנדרשת ליישומים במורד הזרם. הבידוד של תאי מיקרוגליה טהורים ממוחו של עכבר בוגר, במיוחד ממבני מוח קטנים כמו ההיפותלמוס, הוא מאתגר בשל המספר המוגבל של תאי מיקרוגליה. הדיסוציאציה האוטומטית והעדינה של ההיפותלמוס באמצעות טכנולוגיית Miltenyi מאפשרת טיהור של תפוקת מיקרוגליה גבוהה יחסית בזמן קצר עם היכולת להמשיך עד שמונה דגימות בו זמנית עם דיסוציאטור Octo עדין של MACS.
הומוגניזציה של רקמות מלווה בטיהור מיקרוגליה באמצעות טכנולוגיה מבוססת עמודות MACS וחרוזי CD11b+ בגודל ננומטרי סופר-מגנטי. לכן, כל הדגימות מעובדות בדיוק באותו אופן ומניבות תאי CD11b + שלמים. ראוי לציין כי CD11b אינו קיים באופן בלעדי במיקרוגליה, אלא מתבטא גם בתאי שושלת מיאלואידים אחרים, כולל מקרופאגים ומונוציטים9. כדי להגביל זאת, זילוח המוח עם תמיסת מלח קרה כקרח לפני מיצוי ההיפותלמוס (ראה פרוטוקול שלב 2.6) מבטיח חיסול של רוב התאים המיאלואידים, משאיר רק חלק קטן פוטנציאלית של מקרופאגים תושבים או אלה שנצמדו לכלי הדם. המקרופאגים והמונוציטים של מערכת העצבים המרכזית במצב יציב ובריא מהווים אחוז קטן מכלל תאי החיסון במוח (~10% ו-<2% בהתאמה)10,11. לכן, כאשר תאי המוח ממוינים עם חרוזי CD11b+, ניתן לבודד גם מיקרוגליה וגם מקרופאגים, אם כי רובם המכריע הם מיקרוגליה.
התשואה הסופית של תאי מיקרוגליה ושמירה על יכולת הקיום שלהם מאפשרים לנו לבצע ex vivo, כמו גם בדיקות במבחנה, עם היתרון של ניתוח אזורי עניין ספציפיים במוח. הראיות האחרונות הראו כי אוכלוסיית תאי המיקרוגליה הטרוגנית מאוד, ומייצגת ביטוי גנים ספציפיים לאזור ומאפיינים מורפולוגיים ותפקוד 2,12,13. לכן, הפרוטוקול הנוכחי נועד לבודד ולנתח מיקרוגליה בוגרים באופן ספציפי לאזור. ואכן, אנו יכולים לאפיין את הפרופילים הגנטיים, השעתוק והתרגומים של מיקרוגליה היפותלמית בוגרת באמצעות שיטות כמו RT-qPCR וריצוף RNA, כמו גם ביצוע ניתוח פונקציונלי במבחנה.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול הנוכחי מציג את הבידוד של תאי מיקרוגליה היפותלמיים ממוח עכבר בוגר שזה עתה נוקב על ידי מיון תאים המופעל על ידי מגנטית. התוצאות שהוצגו לעיל מאשרות את הטוהר והכדאיות של תאים מבודדים, כמו גם את יעילותה של שיטה זו לאפיון פונקציונלי של מיקרוגליה ex vivo, למשל באמצעות פעילות פגוציטית ו…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
AN נתמך על ידי המכון האוניברסיטאי של צרפת (IUF), אוניברסיטת בורדו, הקרן הצרפתית לחקר המוח (FRC), GLN (קבוצת תזונת שומנים) והסוכנות הלאומית למחקר (ANR, PRC 2023-MicroNRJ). CA נתמכה על ידי Fondation pour la Recherche Médicale (FRM-ARF201809006962). פרויקט זה קיבל מימון מתוכנית המחקר והחדשנות Horizon Europe של האיחוד האירופי במסגרת MSCA Doctoral Networks 2021, No. 101072759 (FuElThEbRaiNIn healtThYaging ומחלות הקשורות לגיל, ETERNITY.
Materials
| Adult Brain Dissociation Kit | Miltenyi | 130-107-677 | The kit contains buffer Z, buffer Y, enzymes A and P, Debris Removal Solution, buffer A (to dissolve enzyme A). |
| Albumin Bovine FrV BSA | EuroMedex | 04-100-812-C | |
| CD11b (Microglia) MicroBeads, human and mouse – small size | Miltenyi | 130-093-636 | |
| CellROX Green Flow Cytometry Assay Kit | Invitrogen | C10492 | |
| Centrifuge Tube, Snap-Pop Lid 15 mL | CellTreat | 978449 | |
| DPBS, calcium, magnesium, glucose, pyruvate | Gibco | 14287-072 | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi | 130-093-237 | |
| gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi | 130-096-427 | |
| Halt Phosphatase Inhibitor Cocktail (100x) | Thermofisher | 78420 | |
| Halt Protease Inhibitor Cocktail, EDTA free (100x) | Thermofisher | 78437 | |
| HBSS (10x), calcium, magnesium, no phenol red | Thermofisher | 14065056 | |
| Latex beads, carboxylate-modified polystyrene, fluorescent red | Sigma-Aldrich | L3280 | |
| LightCycler 480 SYBR Green I Master | Roche | 4707516001 | This reagent was used to perform PCR. |
| MACS SmartStrainers (70 µm) | Miltenyi | 130-110-916 | |
| Micro BCA Protein Assay Kit | Thermofisher | 23235 | |
| M-PER Mammalian Extraction Buffer | Thermofisher | 78503 | |
| MS Columns | Miltenyi | 130-042-201 | Referred as small columns in the protocol. |
| MultiMACS Cell24 Separator Plus | Miltenyi | 130-098-637 | |
| PBSS, pH 7.4 | Thermofisher | 10010023 | |
| qScript XLT cDNA SuperMix | Quanta biosciences | 733-1177 | The kit was used to syntesize cDNA. |
| ReliaPrep RNA Miniprep Systems | Promega | Z6011 | The kit contains 1-Thioglycerol and BL buffer (referred as lysis buffer in the protocol) and it was used to isolate total RNA. |
| Vacutainer safety-lok 21 G | Becton Dickinson | 367282 |
References
- Ginhoux, F., Lim, S., Hoeffel, G., Low, D., Huber, T. Origin and differentiation of microglia. Front Cell Neurosci. 7, 45 (2013).
- Paolicelli, R. C., et al. Microglia states and nomenclature: A field at its crossroads. Neuron. 110 (21), 3458-3483 (2022).
- Ajami, B., Bennett, J. L., Krieger, C., Tetzlaff, W., Rossi, F. M. V. Local self-renewal can sustain CNS microglia maintenance and function throughout adult life. Nat Neurosci. 10 (12), 1538-1543 (2007).
- Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
- Alexaki, V. I. The impact of obesity on microglial function: immune, metabolic and endocrine perspectives. Cells. 10 (7), 1584 (2021).
- Gao, C., Jiang, J., Tan, Y., Chen, S. Microglia in neurodegenerative diseases: mechanism and potential therapeutic targets. Sig Transduct Target Ther. 8 (1), 359 (2023).
- Lee, J. -. K., Tansey, M. G. Microglia isolation from adult mouse brain. Microglia: Methods Mol Biol. 1041, 17-23 (2013).
- Schwarz, J. Using fluorescence activated cell sorting to examine cell-type-specific gene expression in rat brain tissue. J Vis Exp. (2015), (2015).
- Lee, E., Eo, J. -. C., Lee, C., Yu, J. -. W. Distinct features of brain-resident macrophages: microglia and non-parenchymal brain macrophages. Mol Cells. 44 (5), 281-291 (2021).
- Korin, B., et al. High-dimensional, single-cell characterization of the brain’s immune compartment. Nat Neurosci. 20 (9), 1300-1309 (2017).
- Mrdjen, D., et al. High-dimensional single-cell mapping of central nervous system immune cells reveals distinct myeloid subsets in health, aging, and disease. Immunity. 48 (2), 380-395.e6 (2018).
- Grabert, K., et al. Microglial brain region−dependent diversity and selective regional sensitivities to aging. Nat Neurosci. 19 (3), 504-516 (2016).
- Tan, Y. -. L., Yuan, Y., Tian, L. Microglial regional heterogeneity and its role in the brain. Mol Psychiatry. 25 (2), 351-367 (2020).
- Bustin, S. A., et al. The MIQE Guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem. 55 (4), 611-622 (2009).
- . Available from: https://pamgene.com/wp-content/uploads/2022/03/1160-Preparation-Lysates-of-Cell-Lines-or-Purified-Cells-V4.2-2022-03.pdf (2022)
- Fonseca, M. I., et al. Cell-specific deletion of C1qa identifies microglia as the dominant source of C1q in mouse brain. J Neuroinflamm. 14 (1), 48 (2017).
- Simpson, D. S. A., Oliver, P. L. ROS generation in microglia: understanding oxidative stress and inflammation in neurodegenerative disease. Antioxidants. 9 (8), 743 (2020).
- Galloway, D. A., Phillips, A. E. M., Owen, D. R. J., Moore, C. S. Phagocytosis in the brain: homeostasis and disease. Front Immunol. 10, 790 (2019).
- Marsh, S. E., et al. Dissection of artifactual and confounding glial signatures by single-cell sequencing of mouse and human brain. Nat Neurosci. 25 (3), 306-316 (2022).
- DePaula-Silva, A. B., et al. Differential transcriptional profiles identify microglial- and macrophage-specific gene markers expressed during virus-induced neuroinflammation. J Neuroinflammation. 16 (1), 152 (2019).
