Isolamento da microglia hipotalâmica do cérebro de camundongo adulto recém-perfundido por classificação de células ativadas por magnetismo

A microglia corresponde a 5-20% do total de células neurais e são as únicas células gliais que se originam de progenitores eritromieloides no saco vitelino e começam a colonizar o cérebro em desenvolvimento por volta do dia embrionário E9.5 ^1,2. São células de vida longa com a capacidade de se auto-renovar lentamente, independentemente das células derivadas da medula óssea³. Como algumas das células mais altamente dinâmicas, elas são capazes de adquirir diversos fenótipos em resposta a pistas contextuais e ambientais ^2,4. Entre os sinais capazes de modular sua atividade, os danos ao sistema nervoso central (SNC), a atividade neuronal, bem como os nutrientes, são os mais potentes. Um crescente corpo de pesquisas demonstrou o papel fundamental da microglia em lesões, doenças neurodegenerativas e obesidade ^2,5,6. No entanto, o papel preciso da microglia nos processos fisiológicos e na fisiopatologia requer mais estudos. Portanto, sua caracterização transcricional, metabólica e funcional em diferentes condições é de grande importância e requer seu isolamento, uma vez que estudos in situ são apropriados para localização de DNA, RNA e proteínas e comparações qualitativas, bem como caracterização morfológica da microglia.

Existem várias técnicas descritas para o isolamento da microglia, entre as quais estão o método do gradiente de Percoll⁷, a classificação de células por citometria de fluxo (FACS) ⁸ e a classificação de células ativadas magneticamente (MACS). A seleção do método apropriado depende dos objetivos do estudo e do nível de pureza necessário para aplicações a jusante. O isolamento da microglia pura do cérebro de camundongos adultos, especialmente de pequenas estruturas cerebrais como o hipotálamo, é um desafio devido ao número limitado de células microgliais. A dissociação suave automatizada do hipotálamo usando a tecnologia Miltenyi permite a purificação de um rendimento relativamente alto da microglia em um curto espaço de tempo com a capacidade de processar até oito amostras ao mesmo tempo com um gentleMACS Octo Dissociator.

A homogeneização do tecido é seguida pela purificação da microglia usando a tecnologia baseada em coluna MACS e os grânulos CD11b ⁺ de tamanho nanomagnético supermagnético. Portanto, todas as amostras são processadas exatamente da mesma maneira, produzindo células CD11b ⁺ intactas. Vale ressaltar que o CD11b não está presente exclusivamente na microglia, mas também é expresso em outras células da linhagem mieloide, incluindo macrófagos e monócitos⁹. Para limitar isso, a perfusão cerebral com solução salina gelada antes da extração do hipotálamo (consulte a etapa 2.6 do protocolo) garante a eliminação da maioria das células mieloides, deixando apenas uma fração potencialmente pequena de macrófagos residentes ou aderidos aos vasos sanguíneos. Os macrófagos e monócitos residentes de um SNC saudável em estado estacionário constituem uma pequena porcentagem do total de células imunes cerebrais (~ 10% e <2%, respectivamente) ^{10 , 11} . Portanto, quando as células cerebrais são classificadas com esferas CD11b ⁺, tanto a microglia quanto os macrófagos podem ser isolados, embora a grande maioria seja microglia.

O rendimento final da microglia e a manutenção de sua viabilidade nos permitem realizar ensaios ex vivo, bem como in vitro, com a vantagem de analisar regiões cerebrais específicas de interesse. As evidências mais recentes mostraram que a população de micróglias é altamente heterogênea, representando a expressão gênica específica da região e características morfológicas e função ^2,12,13. Portanto, o protocolo atual visa isolar e analisar a micróglia adulta de maneira específica da região. De fato, podemos caracterizar os perfis genéticos, transcricionais e translacionais da microglia hipotalâmica adulta usando métodos como RT-qPCR e sequenciamento de RNA, bem como realizando análises funcionais in vitro.